代婷婷， 林華萍， 董 曉， 刁雅潔， 石紅梅

(河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北石家莊 050017)

皮質(zhì)醇(Cortisol,Cor)又稱氫化可的松，它是一種主要由腎上腺皮質(zhì)束狀帶分泌產(chǎn)生的糖皮質(zhì)激素，為一種應(yīng)激激素，當(dāng)機(jī)體受到感染、手術(shù)、麻醉、疼痛等各種刺激時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，人體體液中的皮質(zhì)醇含量可作為觀察應(yīng)激水平的指標(biāo)。臨床上常將皮質(zhì)醇用作抗炎甾體類激素藥物，其藥理作用主要有抗炎、抗過(guò)敏和免疫抑制、抗核分裂等。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

IFFM-E型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀(西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司)；1810-BC型石英自動(dòng)雙重純水蒸餾器(江蘇省金壇市白塔石英玻儀廠)；FA1104型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)。

皮質(zhì)醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取0.0125 g皮質(zhì)醇標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，溶于少量甲醇，用高純水定容至25 mL，濃度為1.38×10-3mol·L-1。魯米諾儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取魯米諾標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)0.8860 g，溶于7 mL 1.0 mol·L-1NaOH溶液中，用高純水定容至250 mL，濃度為0.02 mol·L-1。Ni(Ⅳ)儲(chǔ)備液：按文獻(xiàn)方法[11]制備,儲(chǔ)備液濃度依據(jù)配合物在波長(zhǎng)410 nm處的吸光度值及其摩爾吸光系數(shù)(ε=1.06×105L·mol-1·cm-1)，由公式A=εbc計(jì)算得到，濃度為2.23×10-3mol·L-1。Ni(Ⅳ)配合物應(yīng)用液用高純水當(dāng)天配制。實(shí)驗(yàn)用水為高純水。

1.2 樣品處理

1.2.1皮質(zhì)醇注射液準(zhǔn)確吸取皮質(zhì)醇注射液(山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，標(biāo)示量5 mg·mL-1300 μL于100 mL容量瓶中，用高純水定容，其有效成分濃度為15 μg·mL-1。

1.2.2尿樣處理取5 mL空白尿樣，加入PbO2攪拌10 min以去除尿酸、硫脲等，然后以10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，用C18固相萃取柱凈化后，取1 mL尿樣稀釋至100 mL，待測(cè)。

圖1 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光流路示意圖

用C18固相萃取柱分離富集待測(cè)尿液中皮質(zhì)醇的含量步驟如下：(1)活化：取1.5 mL水和1.5 mL甲醇依次滴加到固相萃取柱上，滴干，重復(fù)一次，進(jìn)行固相萃取柱的活化；(2)上樣：取1 mL尿樣處理液滴加到固相萃取柱上；(3)洗滌：2 mL水，1 mL 10%甲醇，2 mL 20%丙酮依次洗滌；(4)洗脫：1 mL甲醇溶液洗脫；(5)洗脫液于45 ℃下氮?dú)獯蹈?，溶?.1 mL甲醇，用水定容于100 mL容量瓶中。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)流路如圖1所示。Ni(Ⅳ)溶液首先與魯米諾溶液經(jīng)三通管混合均勻并充分反應(yīng)，產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)，待基線穩(wěn)定后，通過(guò)進(jìn)樣閥將皮質(zhì)醇溶液注入到Ni(Ⅳ)與魯米諾的混合液流中，記錄皮質(zhì)醇對(duì)Ni(Ⅳ)-魯米諾化學(xué)發(fā)光體系增敏的信號(hào)強(qiáng)度，以峰高定量。每次實(shí)驗(yàn)前后均需用高純水將各流路的管道沖洗干凈，待用。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)介質(zhì)及其濃度的影響

2.1.1魯米諾溶液濃度及pH的選擇考察了魯米諾溶液濃度在6.0×10-8～4.0×10-6mol·L-1(含0.01 mol·L-1NaOH)時(shí)皮質(zhì)醇對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。結(jié)果如圖2所示：隨著魯米諾濃度增大，皮質(zhì)醇溶液對(duì)體系的增敏作用增強(qiáng)。當(dāng)魯米諾濃度達(dá)到6.0×10-7mol·L-1時(shí)，增敏作用最強(qiáng)。故選擇魯米諾的最佳濃度為6.0×10-7mol·L-1。

在NaOH溶液濃度為0.0001～0.02 mol·L-1范圍內(nèi)，考察了魯米諾溶液的pH值對(duì)體系發(fā)光強(qiáng)度的影響。結(jié)果如圖3所示：當(dāng)魯米諾溶液中NaOH溶液的濃度為0.01 mol·L-1，即溶液pH=12.0時(shí)，體系的靈敏度最高。

圖2 魯米諾溶液濃度對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響

圖3 魯米諾溶液pH值對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響

2.1.2Ni(Ⅳ)溶液濃度及pH的選擇考察了Ni(Ⅳ)溶液濃度在1.0×10-8～2.0×10-5mol·L-1(含0.01 mol·L-1NaOH)范圍內(nèi)對(duì)該體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響(圖4)。結(jié)果表明：Ni(Ⅳ)溶液的最佳濃度為4.0×10-6mol·L-1。同時(shí)考察了NaOH濃度在0.0001～0.03 mol·L-1范圍內(nèi)Ni(Ⅳ)溶液pH對(duì)體系發(fā)光強(qiáng)度的影響(圖5)，隨著Ni(Ⅳ)溶液pH的增高，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Ni(Ⅳ)溶液pH在12.0～12.3范圍時(shí)，化學(xué)發(fā)光信號(hào)雖增強(qiáng)明顯，但基線噪聲較大，信號(hào)不穩(wěn)定。選擇Ni(Ⅳ)溶液中NaOH的濃度為0.008 mol·L-1即溶液pH=11.9時(shí)，皮質(zhì)醇對(duì)體系的增敏效果好且信噪比最好。

圖4 Ni(Ⅳ)溶液濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響

圖5 Ni(Ⅳ)溶液pH值對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響

2.2 工作曲線、精密度與檢出限

在優(yōu)化條件下，對(duì)濃度為20 ng·mL-1的皮質(zhì)醇標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定11次，根據(jù)每次測(cè)定的相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，計(jì)算得到其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.56%。

2.3 樣品分析

在優(yōu)化的條件下，即魯米諾濃度為6.0×10-7mol·L-1(含0.01 mol·L-1NaOH)，Ni(Ⅳ)濃度為4.0×10-6mol·L-1(含0.008 mol·L-1NaOH)時(shí)，對(duì)皮質(zhì)醇注射液溶液、已處理稀釋過(guò)的尿樣(尿樣取自三甲醫(yī)院中患有腎上腺皮質(zhì)功能減退癥病人。早8點(diǎn)靜脈滴入50 mg后2 h取其尿液，4 ℃保存，處理后測(cè)定)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程計(jì)算得到：注射液中皮質(zhì)醇的含量為4.98 mg·mL-1；尿樣中皮質(zhì)醇的含量為8.36×10-7μg·mL-1。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

取9份皮質(zhì)醇注射液樣品溶液，每份0.1 mL，分別定容至100 mL。在其中依次加入皮質(zhì)醇標(biāo)準(zhǔn)品，制得低、中、高3個(gè)濃度水平的加標(biāo)樣品，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，計(jì)算得回收率，回收率在86.7%～107.5%之間。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品中皮質(zhì)醇加標(biāo)回收率測(cè)定(n=3)

2.5 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理探討

實(shí)驗(yàn)證明，魯米諾在pH=11左右有最佳發(fā)光效率。本研究采用Ni(Ⅳ)配合物做氧化劑，與魯米諾組成新的化學(xué)發(fā)光體系，該體系中Ni(Ⅳ)配合物既可氧化魯米諾產(chǎn)生發(fā)光(基線信號(hào))，又可氧化皮質(zhì)醇，且與皮質(zhì)醇的氧化速度快于魯米諾，使體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。Ni(Ⅳ)配合物的氧化能力與其濃度、pH在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)(濃度過(guò)大，配合物可能聚集；pH過(guò)高，配合物在溶液中的平衡可能改變，均可能使配合物氧化能力下降)。

從對(duì)該體系前期的研究[11]推斷，可能的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理為：Ni(Ⅳ)和魯米諾及皮質(zhì)醇的反應(yīng)均為自由基反應(yīng)，且皮質(zhì)醇與Ni(Ⅳ)反應(yīng)較魯米諾與Ni(Ⅳ)的反應(yīng)快的多，反應(yīng)過(guò)程中皮質(zhì)醇產(chǎn)生的自由基轉(zhuǎn)移給魯米諾一部分，從而使魯米諾自由基增多，發(fā)光體的量增多，使得體系的發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)。

3 結(jié)論

建立了Ni(Ⅳ)配合物流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光新體系測(cè)定皮質(zhì)醇的新方法，對(duì)注射液和人體尿樣中的皮質(zhì)醇進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)該體系可能的化學(xué)發(fā)光機(jī)理進(jìn)行了分析。該方法簡(jiǎn)單、靈敏、快速，可用于實(shí)際樣品中痕量皮質(zhì)醇的測(cè)定。