惠蕓華， 張 璇， 黃冬梅， 王 媛， 于慧娟

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，上海 200090)

孔雀石綠(MG)和結(jié)晶紫(LV)均屬三苯甲烷類陽離子染料，它們對魚類的寄生蟲病、水霉病等均有很好的療效，許多國家曾將其作為殺菌劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。該類染料進入魚體后分別代謝為隱色孔雀石綠(LMG)和隱色結(jié)晶紫(LLV)，由于這兩種化合物及其代謝物均具有潛在的致畸、致癌、致突變等副作用，近20年來許多國家陸續(xù)將其列為水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的禁用藥物[1,2]。亞甲基藍(lán)(MB)是一種人工合成的噻嗪類陽離子染料，是首例用于治療疾病的人工合成的化學(xué)品，它曾成功用于治療細(xì)菌性瘧疾。亞甲基藍(lán)對防治淡水魚的紅嘴病、水霉病、小瓜蟲病等有很好的療效，由于其毒性比孔雀石綠低，近年來作為孔雀石綠等禁藥的替代品在水產(chǎn)品養(yǎng)殖中得到了廣泛應(yīng)用[3]。新亞甲基藍(lán)(NMB)又名堿性藍(lán)24，與亞甲基藍(lán)性質(zhì)用途相同，但目前只用于作為染料和傳感器等方面的應(yīng)用。由于亞甲基藍(lán)對動物體有毒性并有致突變作用，在美國、日本禁止用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[4,5]。

目前，文獻報道與MG、LMG、LV、LLV、MB相關(guān)的主要檢測方法有液相色譜法[6 - 9]、液相色譜-質(zhì)譜法[10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11，12]、毛細(xì)管電泳法[13]、免疫法[14]。而同時測定這5種物質(zhì)的方法未見報道，并且尚無MMB相關(guān)測定方法的報道。本實驗旨在建立水產(chǎn)品中的孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝產(chǎn)物，以及亞甲基藍(lán)和新亞甲基藍(lán)的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，研究采用液-液萃取和固相萃取相結(jié)合的方法凈化樣品，并對檢測和分離參數(shù)進行優(yōu)化研究。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ Quantum Access液-質(zhì)聯(lián)用儀；美國Millipore公司超純水儀；Thermo高速離心機；Supelco公司固相萃取裝置。

孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫、有色孔雀石綠內(nèi)標(biāo)(MG-D5)、隱色孔雀石綠內(nèi)標(biāo)(LMG-D6)，均購自德國Dr Ehrenstotfer 公司；亞甲基藍(lán)、新亞甲基藍(lán)購自美國Sigma-Aldrich Fluka 公司；甲醇、乙腈、二氯甲烷均為色譜純；乙酸銨為優(yōu)級純；鹽酸羥胺、甲酸、對甲苯磺酸均為分析純；水為超純水。

草魚購自上海市農(nóng)貿(mào)市場。去鱗去皮，取背部肌肉，充分絞碎、混勻，-18 ℃保存，備用。

1.2 實驗方法

1.2.1提取稱取5 g(精確至0.01 g)草魚樣品于50 mL離心管內(nèi)，加入乙腈15 mL，旋渦混勻1 min，超聲提取10 min，4 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至100 mL離心管中。向殘渣中加入鹽酸羥胺溶液1.5 mL，對-甲苯磺酸溶液2.5 mL，乙酸銨緩沖溶液(pH=4.5)5 mL，乙腈10 mL，旋渦混勻1 min，超聲提取10 min，4 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至100 mL離心管中，重復(fù)該提取步驟一次，合并上清液。

1.2.2分離凈化在上述100 mL離心管中加入10 mL水、2 mL二甘醇、15 mL二氯甲烷，劇烈振蕩2 min，4 000 r/min離心5 min，將下層溶液轉(zhuǎn)移至100 mL梨形瓶中，繼續(xù)在100 mL離心管中加入乙腈5 mL、二氯甲烷10 mL，振蕩2 min，4 000 r/min離心5 min，將下層溶液合并至100 mL梨形瓶中，繼續(xù)在100 mL離心管中加入15 mL二氯甲烷，振蕩2 min，4 000 r/min離心5 min，合并至100 mL梨形瓶中，40 ℃ 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用5 mL乙腈溶解殘渣，待凈化。

中性氧化鋁不會吸附目標(biāo)分析物，可以過濾掉提取過程中帶進來的油脂，避免油脂進入色譜系統(tǒng)，損壞色譜柱。將中性氧化鋁柱安裝在固相萃取裝置上，用5 mL乙腈活化，轉(zhuǎn)移殘渣溶解液到柱上，同時用50 mL梨形瓶接收流出液，再用乙腈洗梨形瓶兩次，每次2.5 mL，依次過柱，接收合并至50 mL梨形瓶中，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。向梨形瓶中加入乙腈1.0 mL，超聲1 min溶解殘渣，再加入1.0 mL乙酸銨溶液(pH=4.5),超聲1 min溶解殘留物，過0.22 μm濾膜，供液質(zhì)聯(lián)用儀測定。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件:色譜柱：CAPCELL PAK MGII-C18柱(100×2.0 mm，5 μm)。流動相：A:2 mmol/L 乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)，B：甲醇，C：乙腈。流速：0.4 mL/min。梯度洗脫程序如下：0～30 min,75%A-20%B-5%C;3.0～3.01 min,2%A-20%B-78%C,保持至10.0 min;10.0～10.1 min,75%A-20%B-5%C,。進樣量：25 μL。柱溫：30 ℃。質(zhì)譜條件:電噴霧正離子模式(ESI+)，噴霧電壓4 500 V，毛細(xì)管溫度300 ℃，鞘氣壓力20 kPa，輔助氣壓力5 kPa，碰撞氣(Ar)壓力1.5 Pa。SRM優(yōu)化參數(shù)列于表1。

表1 6種化合物的母離子、子離子及碰撞能量

*quantitative ion.

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

普通的C18填料的柱子就可以有效地將孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)、新亞甲基藍(lán)與樣品基質(zhì)分離，實驗中采用CAPCELL PAK MGII-C18作為分離這6種物質(zhì)的色譜柱，結(jié)果表明分離效果和靈敏度都比較理想。

2.2 流動相的優(yōu)化

實驗以乙酸銨、甲醇和乙腈作為流動相進行等度洗脫，結(jié)果表明6組分的分離效果不好，且有嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象。改用梯度洗脫，并且在乙酸銨中加入0.1%的甲酸，分離效果理想，拖尾現(xiàn)象得以明顯改善。故流動相采用含0.1%甲酸的乙酸銨-甲醇-乙腈，梯度洗脫。優(yōu)化梯度洗脫條件見1.3節(jié)。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化及定性、定量離子的選取

將濃度分別為1 μg/mL的孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)、新亞甲基藍(lán)的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜儀中，在m/z150～500范圍內(nèi)以正離子模式進行一級質(zhì)譜全掃描，確定孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)、新亞甲基藍(lán)的分子離子峰；以各個分子離子峰為母離子，對離子源參數(shù)(噴霧電壓、鞘氣、輔助氣、源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離電壓)進行優(yōu)化，確定最佳離子源測定參數(shù)；然后在不同碰撞能量下分別對目標(biāo)化合物進行二級全掃描，以確定目標(biāo)化合物的主要離子碎片，選取離子豐度較高、干擾較小的碎片離子作為目標(biāo)化合物的定性離子和定量離子，如表1所示。

2.4 方法的評價

2.4.1方法的線性范圍將孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)、新亞甲基藍(lán)配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進行分析，以待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比(y)為縱坐標(biāo)，待測物的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)作線性回歸分析。孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)、新亞甲基藍(lán)在1～500 ng/mL的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.9990。

2.4.2方法準(zhǔn)確度和精密度按1.2節(jié)方法對不含目標(biāo)分析物的草魚樣品進行加入回收試驗，添加水平為0.2、2.0、10.0 μg/kg，每個加標(biāo)水平做6個平行，6種待測物的加標(biāo)回收率及精密度(RSD)結(jié)果見表2?？兹甘G、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)、新亞甲基藍(lán)在草魚樣品中添加水平為0.2、2、10 μg/kg時，平均回收率在75.0%～98.5%之間，RSD為3.2%～9.1%，可見該分析方法準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，滿足藥殘檢測的要求。

表2 回收率和精密度結(jié)果(n=6)

2.4.3方法的定量限經(jīng)實驗測得孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)、新亞甲基藍(lán)在加標(biāo)量為0.2 μg/kg時，平均回收率均大于75.0%，精密度均小于10%，信噪比大于10，因此將0.2 μg/kg定為孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)和新亞甲基藍(lán)的定量限。

3 結(jié)論

該方法的建立不僅填補了國內(nèi)孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)、新亞甲基藍(lán)殘留殘留同時檢測的空白，而且對于結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫和新亞甲基藍(lán)的毒性研究具有積極的作用。