沈 駿，熊勇華，許恒毅，郭 亮，*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

生物識(shí)別元件功能化微納米磁性材料在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

沈 駿1，2，熊勇華1，2，許恒毅1，郭 亮1，2，*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

真菌毒素是真菌產(chǎn)生的一類強(qiáng)毒性次級(jí)代謝產(chǎn)物，可通過食品或食物鏈危害人類的健康。建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)方法是控制真菌毒素危害的有效手段之一。功能化微納米磁性材料因具有超順磁性、比表面積大等特性，近年來在建立樣品前處理新方法及生物傳感器分析等領(lǐng)域的應(yīng)用日益增多。本文在概述真菌毒素傳統(tǒng)檢測(cè)方法及微納米磁性材料特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，綜述近期生物識(shí)別元件功能化微納米磁性材料在樣品前處理及利用生物傳感器高靈敏快速檢測(cè)真菌毒素中的應(yīng)用，并對(duì)其發(fā)展進(jìn)行展望。

磁性納米材料；生物識(shí)別元件；真菌毒素

功能化微納米磁性材料是20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的一類新型納米材料，主要包括磁性納米粒子以及基于磁性納米粒子制備的磁性微球等。因其具有比表面積大、在溶液中分散性好、吸附速率快以及有磁響應(yīng)性等特點(diǎn)，越來越多地被應(yīng)用于分析化學(xué)領(lǐng)域。

其中，以功能化微納米磁性材料為吸附劑的磁固相萃 取（magnetic solid phase extraction，MSPE）樣品前處理技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于各類復(fù)雜樣品基質(zhì)中待測(cè)物的富集與純化，可有效提高待測(cè)物的富集效率，簡(jiǎn)化富集、凈化過程，縮短樣品前處理時(shí)間［1］。為進(jìn)一步提高凈化效率，研究人員建立了基于生物識(shí)別元件和磁性材料的磁親和固相萃取法（magnetic affinity solid extraction，MASE）。通過將可特異性結(jié)合待測(cè)物的生物識(shí)別元件（如抗體、適配子、酶、受體、抗原）偶聯(lián)在磁性材料表面制備磁親和固相萃取材料，以分散固相萃取模式凈化、富集樣品中的待測(cè)物，使其在具有MSPE優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，大大提高了吸附的特異性，其流程如圖1所示。與傳統(tǒng)的親和固相萃取柱（affinity solid extraction，ASC）相比，MASE的吸附劑表面積大，在溶液中 分散性好，提高了吸附效率，同時(shí)避免了過柱操作步驟。

圖1　MASEE原理Fig.1 Principle diagram of MASE

此外，生物識(shí)別元件功能化微納米磁性材料作為標(biāo)記物、載體及吸附劑在生物傳感器檢測(cè)中的應(yīng)用亦日趨活躍。生物傳感器由生物識(shí)別元件和各類信號(hào)轉(zhuǎn)換器組成，可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶向目標(biāo)物 的分析和檢測(cè)，具有靈敏度高、選擇性優(yōu)良、操作簡(jiǎn)便及可連續(xù)在線分析等優(yōu)點(diǎn)［2］。將微納米磁性材料的優(yōu)點(diǎn)與生物傳感器結(jié)合，可有效提高生物傳感器設(shè)計(jì)的靈活性及檢測(cè)靈敏度。

真菌毒素（mycotoxins）是由產(chǎn)毒絲狀真菌（主要是青霉屬、曲 霉屬、鐮孢屬）產(chǎn)生的具有廣泛毒性效應(yīng)的次生代謝產(chǎn)物，主要包括黃曲霉毒素（aflatoxins，AF）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）、單端孢霉烯族毒素（如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、伏馬毒素（fumonisins，F(xiàn)B）及麥角生物堿（ergot alkaloids，EA）等。其毒性效應(yīng)主要表現(xiàn)為肝臟受損、腎臟受損、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常、免疫抑制、致癌、致畸及遺傳毒性等［3-4］。真菌毒素可通過被污染的農(nóng)產(chǎn)品及其制成品、飼料進(jìn)入動(dòng)物和人類的食物鏈中，嚴(yán)重危害動(dòng)物和人類健康，并對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)前控制真菌毒素危害的最主要方法是建立方便、有效的檢測(cè)手段，及時(shí)將受污染的樣品從食物鏈中剔除。

目前，真菌毒素的常用監(jiān)控方法包括儀器確證法以及篩查法兩大類［5-7］。其中，色譜法是最為常用的確證檢測(cè)方法，而篩查法則以免疫學(xué)方法為主。此外，近年來出現(xiàn)了多種基于生物傳感器和微流控裝置的真菌毒素檢測(cè)新方法，極大地提高了檢測(cè)的便捷性以及靈敏度。本文綜述表面修飾的生物識(shí)別元件功能化磁性納米材料在真菌毒素各類檢測(cè)方法中的應(yīng)用進(jìn)展，以期為相關(guān)科研工作者提供一定的參考。

1　在色譜儀器分析方法中的應(yīng)用

目前，涉及功能化磁性微納米材料的真菌毒素儀器分析方法主要包括高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、毛細(xì)管電泳法（capillary electrophoresis，CE）結(jié)合熒光檢測(cè)器（fluorescence detector，F(xiàn)LD）或質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）進(jìn)行定量檢測(cè)［8］。其中，表面修飾抗體或適配子的磁親和固相萃取吸附劑，有效簡(jiǎn)化了富集、凈化流程，縮短了前處理時(shí)間，提高了凈化效率。

Kim等［9］在氨基化磁性納米粒子表面偶聯(lián)黃曲霉毒素B1（AFB1）或ZEN單克隆抗體，并以此為吸附劑建立了玉米及多種成品飼料中AFB1和ZEN的MASE前處理方法。以HPLC-FLD為定量方法，Kim詳細(xì)比較了新建MASE方法與商品化免疫親和凈化柱（immunoaffinity chromatography，IAC）方法的回收率及耗時(shí)。結(jié)果表明，新建MASE方法的回收率約高出商品化IAC方法10%左右，而耗時(shí)僅5 min，遠(yuǎn)少于商品化IAC方法（大于30 min）。劉偉偉等［10］亦用表面偶聯(lián)AFB1抗體的磁性材料為吸附劑，建立了植物油中AFB1的MASE方法，并結(jié)合HPLC-FLD進(jìn)行定量分析，檢出限為0.5 ?g/L，平均加標(biāo)回收率 可達(dá)96%。

適配子是另一類重要的核酸類生物識(shí)別元件。Wu Ximei等［11］利用在磁珠表面共價(jià)偶聯(lián)OTA適配子作為吸附劑，特異性識(shí)別并捕獲 不同復(fù)雜食品基質(zhì)（咖啡、面粉、小麥、谷物）中的OTA，然后結(jié)合HPLC進(jìn)行檢測(cè)。該方法與C18固相萃取柱相比，富集凈化產(chǎn)物中的干擾物顯著減少，凈化效率更高。

此外，由于人血清白蛋白（human serum albumin，HAS）與OTA有較高的親和性［12］，Hong等［13］將其共價(jià)固定在功能化磁性納米粒子表面實(shí)現(xiàn)了葡萄酒中OTA的快速選擇性富集。結(jié)合毛細(xì)管電泳/電噴射離子-質(zhì)譜（capillary electrophoresis/electrospray ionization-mass spectrometry，CE/ESI-MS）檢測(cè)，其最低檢測(cè)限（limit of detection，LOD）可達(dá)4 ?g/L。該方法以較廉價(jià)的非抗體類的蛋白作為真菌毒素的生物識(shí)別元件，大大降低了免疫親和探針的成本，為生物識(shí)別元件的選擇提供了一種新思路。

2　在常規(guī)免疫學(xué)檢測(cè)方法中的應(yīng)用

免疫分析方法是生物樣品中毒素殘留檢測(cè)常用的篩查方法，具有簡(jiǎn)單、靈敏、快速及經(jīng)濟(jì)適用等特點(diǎn)。生物識(shí)別元件功能化磁性微納米材料在免疫學(xué)檢測(cè)方法中的應(yīng)用有以下兩種形式。

一種是以抗體功能化磁性微納米材料為吸附劑建立MASE前處理方法，洗脫液用酶聯(lián)免疫吸附法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)。如謝芳等［14］用AFB1抗體修飾的亞微米磁珠富集醬油中的AFB1并結(jié)合ELISA方法檢測(cè)。該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，LOD達(dá)0.05 ?g/L，且與國(guó)標(biāo)中有機(jī)溶劑提取法相比，有機(jī)溶劑使用量少。

另一種則是以磁性粒子作為抗體的固相支持物，在磁性粒子表面進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法（magnetic particle-based enzyme-linked immunosorbent assay，mp-ELISA）。與傳統(tǒng)ELISA方法不同，微納米磁性材料粒徑小，表面積大，偶聯(lián)容量高，溶液中分散性好，能增加反應(yīng)面積，大大提高抗原抗體的反應(yīng)效率。與此同時(shí)，超順磁性使其在反應(yīng)或洗滌后可在外加磁場(chǎng)作用下固定在孔板表面，實(shí)現(xiàn)與剩余反應(yīng)物或洗脫液的有效分離，減小基質(zhì)干擾，操作簡(jiǎn)便。Tudorache等［15］建立了表面偶聯(lián)有AFB1抗體的磁性納米粒子的競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)法。該方法將待測(cè)物與辣根過氧化物酶（horseradis h peroxidase，HRP）標(biāo)記的AFB1結(jié)構(gòu)類似物在反應(yīng)孔中振蕩孵育10 min后，用磁鐵將磁性粒子固定在孔底以除去未結(jié)合反應(yīng)物，然后在無外加磁場(chǎng)作用下進(jìn)行洗滌及顯色反應(yīng)檢測(cè)酶標(biāo)抗原的結(jié)合量，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)物中抗原含量。與當(dāng)時(shí)報(bào)道的直接ELISA或電化學(xué)方法比較，該方法抗原抗體結(jié)合反應(yīng)耗時(shí)僅10 min，靈敏度更高，檢測(cè)限達(dá)0.001 ?g/L。Aqai等［16］在OTA多抗標(biāo)記的磁珠表面進(jìn)行藻紅熒光蛋白標(biāo)記的OTA與樣品中OTA的競(jìng)爭(zhēng)免疫學(xué)反應(yīng)后，將磁珠上熒光蛋白標(biāo)記的OTA洗脫，用流式細(xì)胞儀定量。并將該方法用于小麥或麥片中OTA的檢測(cè)，LOD為0.15 μg/L。

為進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，研究者將抗原抗體的特異性反應(yīng)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)相結(jié)合建立了免疫PCR檢測(cè)法（immuno-PCR，iPCR）［17-18］。Babu等［19］將由物理吸附固定在功能化納米磁珠上的捕獲抗體、交聯(lián)作用在DNA上的檢測(cè)抗體、待測(cè)物AFB1混合，建立了直接法和間接法兩種雙抗夾心免疫PCR技術(shù)，通過反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）檢測(cè)雙抗夾心復(fù)合物上的微量DNA實(shí)現(xiàn)對(duì)AFB1的高靈敏檢測(cè)，LOD為0.1 μg/L。由于受空間位阻影響，直接捕獲法中抗體與磁珠結(jié)合后捕獲抗原的能力降低；而間接捕獲法中的抗體則以游離狀態(tài)捕獲抗原，捕獲效果更佳。實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明，間接捕獲檢測(cè)法靈敏度高于直接捕獲法，說明基于磁性材料的ELISA方法中抗體捕獲抗原方式的重要性。

3　在生物傳感器中的應(yīng)用

3.1在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用

電化學(xué)生物傳感器是由生物識(shí)別元件與電化學(xué)轉(zhuǎn)化器（電位型或電流型的電極）組成的，利用電流或電勢(shì)作為檢測(cè)信號(hào)的分析儀器［20］。其檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)單、靈敏度高。由于可有效提高分析靈敏度，近年來納米顆粒標(biāo)記的生物材料在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用引起了國(guó)內(nèi)外科研工作者的廣泛關(guān)注，但其仍存在如下缺陷：生物分子分離過程復(fù)雜；缺乏快速、簡(jiǎn)便、高效的生物分子固定方法；抗體、抗原等生物活性分子在電極表面的固定量少，且易脫落，致使檢測(cè)靈敏度低、線性范圍窄；檢測(cè)后電極表面的免疫復(fù)合物不易去除，使傳感器界面不能更新，無法反復(fù)使用等［21］。而將磁性納米材料與生物識(shí)別元件相結(jié)合應(yīng)用于不同電化學(xué)傳感器中可有效彌補(bǔ)以上的不足，改進(jìn)傳感器的性能。在磁場(chǎng)作用下，偶聯(lián)有抗體、抗原等生物分子的磁性納米粒子可方便地實(shí)現(xiàn)快速分離富集、靶向定位及從電極表面移除等，從而縮短分析時(shí)間、實(shí)現(xiàn)電極表面的快速更新。此外，利用微納米磁珠可偶聯(lián)大量生物分子的優(yōu)點(diǎn)可使檢測(cè)信號(hào)增強(qiáng)，電子傳遞的化合物加快，從而大幅度提高電化學(xué)檢測(cè)靈敏度?；谏鲜鎏攸c(diǎn)，磁性納米材料在電化學(xué)生物傳感器領(lǐng)域具有重要的意義及廣闊的應(yīng)用前景。近年來基于磁性納米材料的真菌毒素電化學(xué)生物傳感器的相關(guān)研究見表1。這些電化學(xué)傳感器采用的生物識(shí)別元件可分為抗體及核酸適配子兩大類，所用電化學(xué)檢測(cè)原理為伏安法或阻抗法。下面舉例分別說明抗體、核酸適配子及伏安法、阻抗法在其中的應(yīng)用。

表1　基于磁性材料的電化學(xué)傳感器在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用概況Table1 Applications of magnetic nano-material combined with electr ochemical sensor in mycotoxin detection

Barthelmebs等［22］構(gòu)建了以DNA適配子為生物識(shí)別元件，超順磁性納米粒子為其載體，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）為信號(hào)轉(zhuǎn)換元件的電化學(xué)傳感器。利用電極背面的磁鐵，表面偶聯(lián)有OTA適配子的納米磁珠被組裝在工作電極表面。檢測(cè)時(shí)，在反應(yīng)孔中加入含OTA的樣品及ALP標(biāo)記的OTA，與磁珠上的適 配子進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合后洗去未結(jié)合反應(yīng)物。再加入無電化學(xué)活性的萘膦酸，其在ALP催化作用下可轉(zhuǎn)變成具活性的萘酚，再用差分脈沖伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）檢測(cè)萘酚含量。由于磁珠表面存在大量生化反應(yīng)位點(diǎn)及電化學(xué)檢測(cè)方法的引入，該方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中OTA的簡(jiǎn)便、靈敏、快速的檢測(cè)。在葡萄酒中的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)表明，其檢測(cè)限為0.11 μg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）低于5%，重復(fù)性好。與傳統(tǒng)的繁瑣電極修飾過程相比，該方法簡(jiǎn)便地利用外加磁場(chǎng)即可將生物分子快速富集至電極表面。此外，該電極在4 ℃存放4 周后檢測(cè)能力無變化。與抗體相比，以適配子為識(shí)別元件的傳感器具有更好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性。

2010年Hervás等［23］以抗體為識(shí)別元件建立了基于超順磁性磁珠及辣根過氧化物酶標(biāo)記的ZEN（HRP-ZEN）的 電化學(xué)生物傳感器。他首先在微孔板中將ZEN抗體通過G蛋白結(jié)合至磁珠表面，再加入HRP-ZEN及樣品進(jìn)行直接競(jìng)爭(zhēng)免疫學(xué)反應(yīng)；復(fù)合物經(jīng)磁架進(jìn)行磁分離、清洗后復(fù)溶，復(fù)溶液轉(zhuǎn)至一次性絲網(wǎng)印刷碳電極池中；再加HRP底物H2O2及電化學(xué)介質(zhì)對(duì)苯二酚反應(yīng)后用DPV法檢測(cè)，檢測(cè)限為0.007 μg/L。該方法將免疫學(xué)反應(yīng)與電極檢測(cè)分開進(jìn)行，且在電化學(xué)檢測(cè)時(shí)將磁珠磁吸附在反應(yīng)池底部，避免了未結(jié)合抗體及磁珠上抗體附著在電極表面對(duì)電子傳遞的影響，提高了靈敏度。

應(yīng)用電化學(xué)阻抗譜（electrochemical impedance spectr oscopy，EIS）能有效地對(duì)表面目標(biāo)分析物進(jìn)行監(jiān)控，如直接監(jiān)測(cè)表面抗原抗體的反應(yīng)。近年，基于免疫傳感器的電化學(xué)阻抗譜受到特殊的關(guān)注。Zamfir等［24］利用巰基將氨基十一烷硫醇鹽酸鹽自組裝在金電極表面后，戊二醛法偶聯(lián)牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），再將OTA抗體修飾的磁珠固定在其表面來檢測(cè)樣品中的OT A。該復(fù)合物是通過測(cè)定阻抗的變化進(jìn)行定量分析。檢測(cè)結(jié)果表明，EIS線性范圍為0.01～5 μg/L，LOD為0.01 μg/L。與上述兩種方法相比，該方法無需酶標(biāo)OTA參與競(jìng)爭(zhēng)免疫學(xué)反應(yīng)過程，檢測(cè)流程更為簡(jiǎn)單。且檢測(cè)完成后，通過更新表面的磁珠電極即可用于新一輪的檢測(cè)。因此，該免疫阻抗傳感器可反復(fù)使用，降低檢測(cè)成本。

值得指出的是，基于電化學(xué)檢測(cè)的微流控芯片生物傳感器在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用可 極大地縮短分析耗時(shí)。微流控芯片檢測(cè)是以微管道網(wǎng)絡(luò)為結(jié)構(gòu)特征，在芯片上設(shè)計(jì)各功能單元，形成進(jìn)樣、反應(yīng)、分離、檢測(cè)于一體的快速、高效、低耗的高集成度微型分析裝置，易于實(shí)現(xiàn)高通量自動(dòng)化大規(guī)模檢測(cè)。將磁性材料與微流體器件結(jié)合，使磁珠與樣品的混合、反應(yīng)、分離及電極檢測(cè)在微流控芯片上完成，可使微流控檢測(cè)兼具磁珠的操控簡(jiǎn)易性［32-34］。目前真菌毒素的磁珠微芯片檢測(cè)均基于在抗體功能化磁珠表面進(jìn)行的酶標(biāo)真菌毒素與樣品中真菌毒素的競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)。Fernánde z-Baldo等［29］將競(jìng)爭(zhēng)免疫學(xué)反應(yīng)及酶促反應(yīng)設(shè)計(jì)在微流道中。該方法先將免疫磁珠經(jīng)壓力驅(qū)動(dòng)至微流道中可施加磁場(chǎng)的特定區(qū)域，再分別將待檢樣品與OTA-HRP或底物壓力驅(qū)動(dòng)至該區(qū)域進(jìn)行各步反應(yīng)，最后將反應(yīng)產(chǎn)物驅(qū)動(dòng)至電極檢測(cè)。整個(gè)檢測(cè)過程僅耗時(shí)16 min，用于蘋果中OTA的檢測(cè)限為0.05 μg/L。

3.2在光學(xué)生物傳感器中 的應(yīng)用

光學(xué)生物傳感器由生物識(shí)別元件和光學(xué)轉(zhuǎn)換器組成，具有高靈敏度、寬線性范圍、簡(jiǎn)單操作、快速、高活性的發(fā)光反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。將磁性材料應(yīng)用于光學(xué)生物傳感器能有效避免樣品或反應(yīng)體系中可發(fā)光干擾物及未結(jié)合標(biāo)記物對(duì)檢測(cè)的影響。

光學(xué)免疫傳感器根據(jù)標(biāo)記與否可分為有標(biāo)記和無標(biāo)記兩種類型。表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）屬于無標(biāo)記類型，該方法與免疫法相結(jié)合，具有特異性好，靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)［30-31，35］。Zamfir等［24］將表面偶聯(lián)抗體的磁性納米粒子通過磁場(chǎng)固定在SPR傳感器表面，通過測(cè)定共振角的變化檢測(cè)OTA，檢測(cè)限為0.94 μg/L。

標(biāo)記型光學(xué)免疫傳感器是更為常用的光學(xué)傳感器類型，但傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記技術(shù)耐光性差、光強(qiáng)度較弱。因此，近年來建立了一些改進(jìn)的熒光標(biāo)記技術(shù)，并被應(yīng)用于真菌毒素的檢測(cè)。為提高傳統(tǒng)熒光標(biāo)記物的熒光強(qiáng)度、增強(qiáng)抗光漂白性，研究人員將大量有機(jī)熒光染料分子用納米顆粒包裹或通過化學(xué)鍵交聯(lián)在納米顆粒內(nèi)部，以期得到性能更佳的新型熒光納米材料。Tang等［36］合 成了摻雜大量羅丹明分子的二氧化硅納米粒子作為熒光標(biāo)記物，再在其表面偶聯(lián)抗體AFB1（anti-AFB1-SiO2-RB）作為識(shí)別元件，并以AFB1-BSA修飾的磁性納米顆粒作為免疫探針，檢測(cè)時(shí)將兩者與樣品混合發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)。由于免疫探針帶磁性，所得識(shí)別元件-免疫探針復(fù)合物可方便、快速地通過磁分離、清洗及重懸等步驟進(jìn)行凈化、富集。所得免疫復(fù)合物可用ELISA微孔板讀取儀或程序注射流系統(tǒng)（sequential injection，SI）兩種方法進(jìn)行熒光檢測(cè)：前者LOD為0.2 μg/L；后者LOD為0.1 μg/L。

上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料（upconversion nanoparticles，UCNPs）是一類摻雜稀土元素的無機(jī)納米材料，可在近紅外光激發(fā)下發(fā)射可見光。大部分生命物質(zhì)在近紅外光激發(fā)時(shí)共振吸收非常小，因此其用于食品樣品檢測(cè)時(shí)檢測(cè)背景低，利于提高檢測(cè)靈敏度。Wu Shijia等［37］建立了一種以適配子為識(shí)別元件，NaYF4:Yb，Er UCNPs為標(biāo)記物的基于競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制的OTA上轉(zhuǎn)換熒光檢測(cè)方法。首先通過生物素/親和素介導(dǎo)，分別將OTA適配子與磁性納米粒子、與適配子序列互補(bǔ)的寡核苷酸鏈與UCNPs相偶聯(lián)。再將兩種復(fù)合物共孵育，在兩條互補(bǔ)的寡核苷酸鏈的相互作用下上轉(zhuǎn)換納米粒子 結(jié)合至磁性粒子上。檢測(cè)時(shí)將上述結(jié)合后的產(chǎn)物與待測(cè)樣品混合，樣品中的OTA可將UCNPs從磁性材料上競(jìng)爭(zhēng)下來。磁回收、清洗磁性粒子，通過測(cè)定混合后熒光強(qiáng)度降低的程度進(jìn)行定量，檢測(cè)靈敏度為0.000 1 μg/L。磁性材料的應(yīng)用使熒光復(fù)合物可方便地實(shí)現(xiàn)與基質(zhì)中熒光干擾物的分離，從而降低檢測(cè)背景，提高檢測(cè)靈敏度。同年Wu Shijia等［38］還報(bào)道了一種同時(shí)檢測(cè)AFB1和OTA的上轉(zhuǎn)換熒光競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)法。該方法將分別用AFB1或OTA標(biāo)記的兩種磁性納米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs）以及分別用AFB1或OTA抗體標(biāo)記的兩種發(fā)光波長(zhǎng)不同的UCNPS和待測(cè)樣品混合進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)，磁回收免疫復(fù)合物MNPs-UCNPS后測(cè)定熒光強(qiáng)度。由于反應(yīng)產(chǎn)物中MNPs-UCNPS量與AFB1或OTA呈負(fù)相關(guān)，故可通過兩種UCNPS各自熒光信號(hào)的減弱程度實(shí)現(xiàn)樣品中AFB1或OTA的同時(shí)檢測(cè)。該方法對(duì)AFB1和OTA的最低檢測(cè)限可達(dá)0.01 μg/L。

電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法（electrochemiluminescent immunoassay，ECLIA）是一種既具有電化學(xué)發(fā)光法的靈敏高、背景信號(hào)低及可簡(jiǎn)單地通過調(diào)節(jié)電極電壓進(jìn)行控制等特點(diǎn)，又具有免疫學(xué)檢測(cè)的高選擇性的檢測(cè)方法，適于食品等復(fù)雜基質(zhì)中痕量物質(zhì)的快速分析。量子點(diǎn)（quantum dot，QD）是一類以碲化鎘（CdTe）、硒化鎘（CdSe）硫化鎘（CdS）等為主要成分的具有電化學(xué)發(fā)光和光致發(fā)光特性的新型納米熒光材料。與傳統(tǒng)有機(jī)熒光標(biāo)記物比較，其熒光強(qiáng)度較高、穩(wěn)定性好、激發(fā)波長(zhǎng)較寬，越來越多地被用于目標(biāo)分子的標(biāo)記和檢測(cè)［39］。目前，有關(guān)量子點(diǎn)在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用還很少。Gan Ning等［40］建立了一種基于磁性氧化石墨烯及CdTe量子點(diǎn)標(biāo)記物的超靈敏黃曲霉毒素M1（AFM1）電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法。該方法先用磁性氧化石墨烯吸附樣品中的AFM1后，與抗體標(biāo)記的量子點(diǎn)-碳納米管復(fù)合物混合孵育。所得免疫復(fù)合物經(jīng)磁回收后滴至絲網(wǎng)印刷碳電極表面，通過檢測(cè)電化學(xué)熒光信號(hào)定量，奶樣中AFM1檢測(cè)限低至3×10-4μg/L。該方法中磁性材料的應(yīng)用使免疫復(fù)合物容易被分離、洗滌，避免了食品基質(zhì)的干擾，從而利于提高靈敏度，簡(jiǎn)化前處理流程，縮短分析時(shí)間。

4　結(jié) 語

綜上所述，基于表面偶聯(lián)容量大、可在液相中分散以及易于操控等優(yōu)良特性，生物識(shí)別元件功能化磁性微納米材料在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用日益增多，有效簡(jiǎn)化了真菌毒素的檢測(cè)流程、縮短了檢測(cè)時(shí)間并提高了檢測(cè)靈敏度。其應(yīng)用方法有多種，各種方法都具有優(yōu)缺點(diǎn)。因此，應(yīng)依據(jù)檢測(cè)要求、檢測(cè)條件等具體情況選擇適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)定待測(cè)樣品。磁性材料應(yīng)用于樣品前處理中并結(jié)合色譜法檢測(cè)，定量準(zhǔn)確、靈敏度高，但是需要昂貴的儀器，有機(jī)試劑用量較大，危害環(huán)境及實(shí)驗(yàn)人員健康［41］；在常規(guī)免疫學(xué)檢測(cè)中，酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法具有靈敏、簡(jiǎn)單、快速等特點(diǎn)，但干擾因素較多，對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成一定影響；在生物傳感器檢測(cè)中，與常規(guī)的ELISA方法相比，利用EIS、熒光標(biāo)記/電化學(xué)發(fā)光、微流控等技術(shù)的免疫傳感器具有特異性強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)范圍大及可以實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。但是，目前已報(bào)道的基于磁性微納米材料的真菌毒素免疫傳感器在再生性、穩(wěn)定性、使用壽命等方面的研究較少，限制了它的實(shí)際應(yīng)用及商業(yè)化前景，需要進(jìn)一步加強(qiáng)。此外，將生物識(shí)別元件偶聯(lián)至磁性材料表面易造成識(shí)別元件的親和力下降，影響富集效率及傳感器檢測(cè)靈敏度。因此，研究與固相界面偶聯(lián)對(duì)生物識(shí)別元件活性影響的機(jī)制，對(duì)制備生物識(shí)別元件功能化磁性微納米材料具有重要的意義。

雖然目前生物識(shí)別元件功能化磁性微納米材料在真菌毒素檢測(cè)中的研究已取得了一定的成果，但與化學(xué)合成的傳統(tǒng)SPE材料相比，生物識(shí)別元件制備流程復(fù)雜、費(fèi)用昂貴且無法重復(fù)利用等缺陷限制了其應(yīng)用。因此，開發(fā)穩(wěn)定性高、可重復(fù)使用、成本低，同時(shí)兼具特異識(shí)別能力的新型識(shí)別元件，并將其用于功能化修飾磁性微納米材料是識(shí)別元件功能化磁性微納米材料的重要發(fā)展方向之一。表面分子印跡磁性材料以分子印跡聚合物為識(shí) 別元件，兼具識(shí)別特異性和高穩(wěn)定性［42］，制備相對(duì)簡(jiǎn)單，可有效降低檢測(cè)成本，有望成為真菌毒素檢測(cè)的重要工具。

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Application of Biological Recognition Element-Based Functional Magnetic Micro/Nano-Material in Mycotoxin Determination

SHEN Jun1，2， XIONG Yonghua1，2， XU Hengyi1， GUO Liang1，2，*
（1. State Key Laboratory of Food Science and Technology， Nanchang University， Nanchang 330047， China；2. Sino-German Joint Research Institute， Nanchang University， Nanchang 330047， China）

Mycotoxins are small secondary metabolites with high toxicity produced by a few fungal species. They are harmful to human and animal health by contaminating food and entering the food chain. One of the effective approaches for controlling mycotoxin hazard is to develop rapid， accurate and sensitive analytical methods. Recently， the functionalized magnetic materials have been widely applied in sample pretreatment and biosensor detection due to their good characteristics such as superparamagnetization and high specific surface area. In this review the traditional mycotoxin detection methods and the merits of magnetic materials are summarized. The emerging sample pretreatment methods and biosensor detection methods involving magnetic nano-materials for mycotoxin determination are discussed in detail， and future research trends are proposed.

magnetic nano-material； bio-recognition element； mycotoxins

TS201.6

A

1002-6630（2015）03-0228-06

10.7506/spkx1002-6630-201503044

2014-04-13

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）項(xiàng)目（2013CB127804）；國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31360385）

沈駿（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c分析。E-mail：moscot198911@163.com

郭亮（1974—），男，副研究員，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：bioguo@163.com