田玉娟，周 康*，韓新鋒，劉書亮

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

乳制品中高產(chǎn)雙乙酰乳酸菌的篩選及鑒定

田玉娟，周 康*，韓新鋒，劉書亮

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

以四川省生鮮乳和發(fā)酵乳為原料，利用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行分離篩選，共分離出39 株乳酸菌，對其中37 株進(jìn)行產(chǎn)雙乙酰的初篩，分離出7 株產(chǎn)量較高的菌株，最后從這7 株中確定出1 株產(chǎn)雙乙酰量最高的乳酸菌YJ-110，通過分光光度計法測得該菌株雙乙酰的產(chǎn)量為23.826 mg/L。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特性和16S rDNA分子鑒定，確定該菌為嗜檸檬酸明串珠菌（Leuconostoc citreum）。

雙乙酰；分離鑒定；明串珠菌

近幾年，隨著酸奶產(chǎn)量的逐年遞增，影響人們選擇酸奶的因素不僅僅是其功能性，另一個重要因素就是它的風(fēng)味。酸奶的風(fēng)味來源于乳酸和羰基化合物，其中雙乙酰是構(gòu)成酸奶風(fēng)味的主要成分，因此酸奶中雙乙酰的含量檢測對酸奶風(fēng)味評價尤為重要［1-2］。雙乙酰，又名丁二酮、二乙酰，經(jīng)稀釋后呈強(qiáng)烈的奶油香氣，是乳制品中一種重要的風(fēng)味物質(zhì)，主要用于配制奶制品香精（黃油、乳酪、牛奶、酸乳酪）和香草、巧克力、糖果、堅果、咖啡以及水果等香精［3-5］。目前乳品中雙乙酰含量的測定方法主要有紫外分光光度計比色法、氣相色譜法等［6-8］。鄰苯二胺比色法由于其方法簡單容易操作，儀器設(shè)備簡易，適宜在實(shí)驗室推廣等特點(diǎn)而得到普遍應(yīng)用。但目前國內(nèi)雙乙酰的生產(chǎn)工藝主要是采用亞硝化法，但該工藝在制備過程產(chǎn)生大量硫酸氫鈉，難以回收，且亞硝酸類物質(zhì)毒性大、沸點(diǎn)低，對環(huán)境危害嚴(yán)重［9-10］。隨著人們生活水平的提高，以及對食品安全的關(guān)注度不斷提升，其使用效果和安全性已經(jīng)不能滿足消費(fèi)者和食品香精香料行業(yè)的發(fā)展需求。因而，國內(nèi)外的研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向了采用崇尚自然、回歸自然的微生物發(fā)酵法來制備雙乙酰［11-12］。

本實(shí)驗從四川省本地生鮮乳和發(fā)酵乳中分離篩選高產(chǎn)雙乙酰的乳酸菌菌株，通過生理生化特性和16S rDNA鑒定其屬種，并用紫外分光光度計比色法測得其含量。以期為解決以化學(xué)合成生產(chǎn)雙乙酰帶來的環(huán)境污染等一系列的問題奠定理論基礎(chǔ)，為滿足食品行業(yè)對天然雙乙酰等風(fēng)味物質(zhì)的需求提出發(fā)展方向。

1　材料與方法

1.1菌種與試劑

菌種分離自四川本地的生鮮乳和發(fā)酵乳制品。選用乳酸菌培養(yǎng)基（MRS）作為微生物生長培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）：葡萄糖2%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、硫酸鎂0.058%、硫酸錳0.025%、吐溫-80 0.1%，pH 6.5。含有12%脫脂乳粉的脫脂乳培養(yǎng)基。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)用Taq酶、Marker DL2000、Golden View、Loading Buffer和TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒-離心柱型寶生物工程（大連）有限公司；雙乙酰溶液標(biāo)準(zhǔn)品、4 mol/L鹽酸、1%鄰苯二胺、16%三氯乙酸均為分析純。

PCR通用引物27F，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成：上游引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。

1.2方法

1.2.1乳酸菌的初篩

取生鮮乳和發(fā)酵乳樣品各25 mL，分別加入裝有225 mL無菌生理鹽水的無菌三角瓶中，充分振搖，進(jìn)行10 倍梯度稀釋。分別取稀釋度為10-1、10-3、10-5、10-7的稀釋液1 mL傾注于添加了1.5% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基上，在37 ℃條件下培養(yǎng)48～72 h后，選取優(yōu)勢菌落劃線分離。將分離純化后的乳酸菌菌株進(jìn)行接觸酶實(shí)驗和革蘭氏染色。

1.2.2產(chǎn)雙乙酰菌株的復(fù)篩

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：將12%的脫脂乳培養(yǎng)基121 ℃滅菌7 min后迅速冷卻，配制質(zhì)量濃度為0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0 mg/L的雙乙酰溶液［13］。取各質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)液10 mL，加入同等體積16%三氯乙酸溶液，振蕩搖勻，靜置，取10 mL上清液均分入2 支試管中。1號管中加入0.5 mL 1%鄰苯二胺溶液，2號管作為對照，振搖后黑暗靜置30 min，分別加入4.0 mol/L HCl 溶液，1號管2.0 mL，2號管2.5 mL，終止反應(yīng)。在335 nm波長處測定各質(zhì)量濃度對應(yīng)的OD335nm值。以雙乙酰質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，OD335nm值為縱坐標(biāo)繪制雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)曲線［14］。

乳酸菌產(chǎn)雙乙酰含量的測定：將12%的脫脂乳培養(yǎng)基121 ℃滅菌7 min后迅速冷卻，接種2%乳酸菌菌懸液，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，取10 mL上清液，分兩支試管，每支5 mL，按上述方法測定各OD335nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算出雙乙酰的含量。每次實(shí)驗做3 個平行取平均值，篩選出產(chǎn)雙乙酰較多的菌株。

1.2.3PCR擴(kuò)增與16S rDNA的鑒定

用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取乳酸菌的總DNA，并以此為模板，擴(kuò)增其16S rDNA序列。25 μL擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序分別為：12.5 ?L 2×PCR Master Mix，1 ?L F-Nuc（10 μmol/L），1 ?L R-bla（10 μmol/L），1 ?L模板DNA，9.5 ?L ddH2O；94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s、56 ℃退火45 s、72 ℃延伸1.5 min以上循環(huán)30 次，最后延伸72 ℃ 10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及DL2000 Marker各5 μL，采用1%瓊脂糖凝膠（含Golden View）電泳方法檢測，電壓85 V，水平電泳50 min，用凝膠成像儀觀察、拍照。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，應(yīng)在預(yù)計的分子質(zhì)量，約1 500 bp 處出現(xiàn)單一DNA條帶，然后將圖像拍照保存。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物寄至生工生物工程（上海）股份有限公司使用通用引物27F雙向測通。將取得的16S rDNA基因測序結(jié)果進(jìn)行BLAST在線分析，進(jìn)行同源性序列相似度比較，根據(jù)其同源性鑒定菌種。

1.2.4生理生化實(shí)驗鑒定

采用糖（醇）發(fā)酵實(shí)驗、H2O2酶實(shí)驗、產(chǎn)硫化氫實(shí)驗、精氨酸水解實(shí)驗對菌株進(jìn)行鑒定。

2　結(jié)果與分析

2.1乳酸菌的篩選結(jié)果

2.1.1乳酸菌的初篩結(jié)果

挑取優(yōu)勢菌落，分別劃線于添加1.5% CaCO3MRS培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，初步分離純化出菌株39 株，經(jīng)過革蘭氏染色鏡檢，接觸酶反應(yīng)，保存革蘭氏陽性，接觸酶陰性菌株37 株。如圖1所示，菌株YJ-110在MRS固體平板上直徑為1～2 mm，白色，不透明，菌落凸起有溶鈣圈，光滑圓整，邊緣整齊。革蘭氏染色為G+菌，橢球狀，少數(shù)成對或成鏈狀，無芽孢。

圖1　菌株YJ-110的菌落特征（a）及個體形態(tài)（b）圖（10×10000）Fig.1 Colony characteristics （a） and morphological features （b） of strain YJ-110 （10×100）

2.1.2產(chǎn)雙乙酰菌株的初篩結(jié)果

采用鄰苯二胺顯色法測定雙乙酰的含量，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.040 3x-0.033 2（R2=0.998 6），表明總誤差中只有0.14%屬于隨機(jī)因素的影響，故該回歸直線可用于確定待測樣的雙乙酰含量。

以初篩37 株菌株活化后，菌齡為18 h的培養(yǎng)菌液，按2%接種于12%的脫脂乳培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，用紫外分光光度計測得OD335nm值，根據(jù)雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程可計算出37 株菌株產(chǎn)雙乙酰的含量，結(jié)果見表1。YJ-103、YJ-105、YJ-110、YJ-202、YJ-203、YJ-322、YJ-324這7 株菌產(chǎn)雙乙酰的能力較強(qiáng)，因此將產(chǎn)量較高的這7 株菌進(jìn)行下一步復(fù)篩實(shí)驗。

表1　產(chǎn)雙乙酰菌株初篩結(jié)果Table1 Results of preliminary screening for diacetyl production

2.1.3產(chǎn)雙乙酰菌株的復(fù)篩結(jié)果

將初篩所得的7 株菌株活化，取菌齡為18 h的菌懸液，以2%量接種于12%的脫脂乳培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h后，測得OD335nm值，根據(jù)所得雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程可計算出7 株菌株產(chǎn)雙乙酰的含量，結(jié)果見表2。YJ-110菌株是產(chǎn)雙乙酰含量最高的菌株，產(chǎn)雙乙酰的平均量為23.826 mg/L。對比表1中的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)同樣在37 ℃、24 h培養(yǎng)條件下，通過搖床培養(yǎng)菌株較靜置培養(yǎng)產(chǎn)雙乙酰的含量有所增加。這主要可能是由于溶氧量改變導(dǎo)致的。

表2　產(chǎn)雙乙酰菌株復(fù)篩結(jié)果（n=3）Table2 Results of secondary screening for diacetyl production （n=3）

2.2菌種的鑒定

2.2.1生理生化鑒定結(jié)果

對菌株YJ-110進(jìn)行生理生化實(shí)驗，測定結(jié)果查閱《細(xì)菌鑒定手冊》和《伯杰氏手冊》，鑒定菌株YJ-110為嗜檸檬酸明串珠菌（Leuconostoc citreum），結(jié)果見表3。

表3　菌株YJ-110的生理生化反應(yīng)鑒定Table3 Identification of strain YJ-110 by physiological characteristics and biochemical reactions

2.2.2分子生物學(xué)鑒定

對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，并將結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST在線分析，其同源性序列相似度比較發(fā)現(xiàn)，與Leuconostoc citreum KM20最接近，相似度為99%。圖2為所篩37 株菌中部分菌株的16S rDNA的電泳圖，可以發(fā)現(xiàn)所有的菌株序列長度均在1 500 bp左右，在1 000～2 000 bp之間，符合目的基因的分子質(zhì)量。

圖2　菌株的16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis patterns of 16S rDNA

綜合細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA比對，該菌株鑒定為嗜檸檬酸明串珠菌（Leuconostoc citreum）。

3　結(jié) 論

雙乙酰測定過程中，樣品的處理是必要的過程。劉鵬等［15］在測定樣品雙乙酰時，先將樣品用蒸餾水稀釋后，采用蒸餾的方法，利用乙醚等有機(jī)溶劑冰浴回收，然后萃取得到雙乙酰待測樣品。但發(fā)現(xiàn)這種方法耗時長，樣品中的雙乙酰在萃取回收時有一定的損失。所以本實(shí)驗用16%的三氯乙酸將樣品中的蛋白沉淀，然后用離心機(jī)離心過濾得到透明溶液再進(jìn)行測定。這種方法需要時間少，也減少了樣品中雙乙酰的損失，保證了測定的準(zhǔn)確性［16-17］。

在進(jìn)行產(chǎn)雙乙酰菌株篩選的過程中，分別對培養(yǎng)菌株進(jìn)行了初篩和復(fù)篩。將初篩和復(fù)篩的方案和數(shù)據(jù)進(jìn)行對比后，發(fā)現(xiàn)同樣在37 ℃、24 h培養(yǎng)條件下，通過搖床培養(yǎng)菌株較靜置培養(yǎng)產(chǎn)雙乙酰的含量有所增加，這與Vedamuthu［18］報道的在生產(chǎn)中振蕩培養(yǎng)可以促進(jìn)雙乙酰生成的結(jié)果相符，也與邵亞東［19］的結(jié)論有相似之處。對于雙乙酰含量測定，邵亞東［19］篩選的最高產(chǎn)雙乙酰菌株QH5-6產(chǎn)量達(dá)34.34 mg/L，彭濤等［20］篩選的最高產(chǎn)雙乙酰菌株S1產(chǎn)量為16.287 mg/L，與本實(shí)驗研究所得的數(shù)據(jù)有一定的差別，究其原因可能是由于實(shí)驗材料的不同或者紫外分光光度計的光源強(qiáng)弱等因素造成的差異。

本實(shí)驗從采集的郫縣生鮮乳和伊利暢輕原味風(fēng)味發(fā)酵乳中分離得到的39 株乳酸菌，經(jīng)兩次篩選出一株產(chǎn)雙乙酰能力最強(qiáng)的菌株YJ-110，通過細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA比對，鑒定YJ-110菌株為嗜檸檬酸明串珠菌。該菌株的獲得不僅可為解決因化學(xué)合成生產(chǎn)雙乙酰帶來的環(huán)境污染等一系列問題提供理論基礎(chǔ)，也可為滿足食品行業(yè)對天然雙乙酰等風(fēng)味物質(zhì)的需求提供實(shí)用價值。

［1］ 金鵬. 益生菌研究進(jìn)展［J］. 農(nóng)產(chǎn)品加工: 創(chuàng)新版， 2009（11）: 70-72.

［2］ PASSERINI D， LAROUTE V， CODDEVILLE M， et al. New insights into Lactococcus lactis diacetyl- and acetoin- producing strains isolated from diverse origins［J］. International Journal of Food Microbiology， 2013， 160（3）: 329-336.

［3］ 孫寶國， 何堅. 香料化學(xué)與工藝學(xué)［M］. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社， 2004: 172-174.

［4］ DAY G， LEBOUF R， GROTE A， et al. Identification and measurement of diacetyl substitutes in dry bakery mix production［J］. Jounral of Occupational and Environmental Hygiene， 2011， 8（2）: 93-103.

［5］ MORE S S， RAZA A， VINCE R. The butter flavorant， diacetyl，forms a covalent adduct with 2-deoxyguanosine， uncoils DNA，and leads to cell death［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2012， 60（12）: 3311-3317.

［6］ RAMOS R M， PACHECO J G， GONCALVES L M， et al. Determination of free and total diacetyl in wine by HPLCUV using gas-diffusion microextraction and pre-column derivatization［J］. Food Control， 2011， 24: 220-224.

［7］ OJEDA A G， WROBEL K， ESCOBOSA A R C， et al. Highperformance liquid chromatography determination of glyoxal， methylglyoxal， and diacetyl in urine using 4-methoxy-ophenylenediamine as derivatizing reagent［J］. Analytical Biochemistry， 2014， 449: 52-58.

［8］ 呂嘉櫪， 李成濤. 酸奶中中丁二酮含量的測定方法初探［J］. 中國乳品工業(yè)， 2006， 34（1）: 21-22.

［9］ 歐陽天惠， 田玉紅， 張浩， 等. 丁二酮的合成研究［J］. 北京工業(yè)大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版， 2008， 26（5）: 1-4.

［10］ TEUSINK B， SMID E J. Modelling strategies for the industrial exploitation of lactic acid bacteria［J］. Nature Reviews Microbiology， 2006， 4（1）: 45-56.

［11］ 汪薇， 肖燕清， 白衛(wèi)東. 符合乳酸菌發(fā)夾產(chǎn)雙乙酰的研究［J］. 食品工業(yè)科技， 2011， 32（7）: 214-216.

［12］ SILVA G P， MACK M， CONTIERO J. Glycerol: a promising and abundant carbon source for industrial microbiology［J］. Biotechnology Advances， 2009， 27（1）: 30-39.

［13］ 呂嘉櫪， 韓迪， 李成濤. 乳品中雙乙酰檢測方法研究［J］. 食品科學(xué)，2007， 28（1）: 276-277.

［14］ IMHOF R， GLATTLI H， BOSSET J. Volatile organic compounds produced by thermophilic and mesophilic mixed strain dairy starter cultures［J］. Federal Dairy Research， 1994， 27（5）: 442-449.

［15］ 劉鵬， 王丹. 酸奶中聯(lián)乙酰含量測定方法的初步探討［J］. 中國乳品工業(yè)， 1992， 20（4）: 60-62.

［16］ BORTNOWSKA G. Effects of pH and ionic strength of NaCl on the stability of diacetyl and （-）-α-pinene in oil-inwater emulsions formed with food-grade emulsifiers［J］. Food Chemistry， 2012， 135: 2021-2028.

［17］ de LEONARDIS A， LOPEZ F， NAG A， et al. Occurrence and persistence of diacetyl in unfermented and fermented milk［J］. European Food Research and Technology， 2013， 236（4）: 691-697.

［18］ VEDAMUTHU E R. The Dairy Leuconostoc use in dairy products［J］. Journal of Dairy Science， 1994， 77（9）: 2725-2737.

［19］ 邵亞東. 傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌產(chǎn)雙乙酰特性的研究［D］. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2007.

［20］ 彭濤， 潘道東， 曾小群， 等. 產(chǎn)丁二酮乳酸菌發(fā)酵的篩選及其發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］. 中國食品學(xué)報， 2011， 11（8）: 34-41.

Isolation and Identification of High-Level Diacetyl-Producing Lactic Acid Bacteria from Milk Products

TIAN Yujuan， ZHOU Kang*， HAN Xinfeng， LIU Shuliang
（College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Ya’an 625014， China）

In this study， using MRS medium， we isolated 39 strains from raw milk and fermented milk from Sichuan province， of which 37 were found to be capable of diacetyl. Seven strains with increased diacetyl-producing ability were selected from the 37 strains and YJ-110， a Lactobacillus strain， produced the highest yield （23.826 mg/L as measured by spectrophotometer） of diacetyl among the seven strains. Based on morphological， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences， this strain was identified as Leuconostoc citreum.

diacetyl； isolation and identification； Leuconostoc citreum

TS254

A

1002-6630（2015）03-0162-04

10.7506/spkx1002-6630-201503031

2014-02-21

田玉娟（1990—），女，本科，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：690813931@qq.com

周康（1983—），男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：kang_zhou@163.com