常 飛，楊雪果，肖士成，段旭昌，*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西楊凌華興羊產(chǎn)業(yè)科技發(fā)展有限公司，陜西 楊凌 712100）

脫脂羊腦蛋白酶解條件優(yōu)化及酶解產(chǎn)物體外抗氧化活性

常 飛1，楊雪果1，肖士成2，段旭昌1，*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西楊凌華興羊產(chǎn)業(yè)科技發(fā)展有限公司，陜西 楊凌 712100）

以脫脂羊腦蛋白為原料，采用響應(yīng)面（response surface method，RSM）法建立脫脂羊腦蛋白的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解回歸模型，優(yōu)化酶解工藝條件，在體外研究脫脂羊腦中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的抗氧化性能。結(jié)果表明：脫脂羊腦蛋白底物質(zhì)量濃度為3.03 g/100 mL，酶添加量為5 653.20 U/g，溫度為39.4 ℃時(shí)，脫脂羊腦蛋白水解度最高，達(dá)到（14.59±1.26）%。當(dāng)脫脂羊腦蛋白水解度為（14.39±1.17）%時(shí)，酶解產(chǎn)物對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羥自由基（?OH）清除能力最強(qiáng)；當(dāng)脫脂羊腦蛋白水解度為（12.48±0.71）%時(shí) ，酶解產(chǎn)物對(duì)超氧陰離子自由基（O2-?）清除能力和總還原能力最強(qiáng)；當(dāng)脫脂羊腦蛋白水解度為（12.48±0.71）%時(shí)，酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基、?OH、O2-?、亞硝酸根陰離子的IC50分別為2.49、3.13、10.37、10.89 mg/mL，酶解產(chǎn)物對(duì)Fe2+螯合率的IC50為7.48 mg/mL，證明脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物具有一定抗氧化活性。

羊腦蛋白；酶解產(chǎn)物；響應(yīng)面；抗氧化活性

羊腦，為?？苿?dòng)物山羊或綿羊的腦髓，富含抗壞血酸、核黃素、煙酸、硫胺素、卵磷脂、腦苷脂、蛋白質(zhì)、脂肪、鈣、磷、鐵等營(yíng)養(yǎng)成分及神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)肽、乙酰膽堿及黏多糖等多種特殊功能成分。《本草綱目》記載，羊腦味甘，性溫，微毒，歸心、肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)虛健腦，潤(rùn)膚作用，中醫(yī)用于主治體虛頭昏，皮膚皸裂，筋傷骨折等癥。羊腦中的腦啡肽能夠激活處于抑制沉睡狀態(tài)的腦細(xì)胞，對(duì)因腦損傷導(dǎo)致的后遺癥有很好的恢復(fù)作用；羊腦中的生長(zhǎng)抑素（somatosatin）可以抑制生長(zhǎng)激素活性；促腎上腺皮質(zhì)激素（adreno-cortico-tropic-hormone）可以維持腎上腺正常形態(tài)和功能。

酶解食源性蛋白制備活性肽是目前關(guān)于食品蛋白功能性的研究熱點(diǎn)之一，近年來研究者從食源性蛋白制備了 多種能抑制自由基產(chǎn)生和清除自由基的抗氧化功能肽。Memarpoor-Yazdi等［1］利用超濾、反相液相色譜等分離技術(shù)從大棗蛋白酶解液中分離出兩種抗氧化肽，其分子質(zhì)量分別為678.3、482.27 kD；張苗等［2］從甘薯蛋白酶解液中分離純化出了Thr-Tyr-Gln-Thr-Phe、Ser-Gly-Gln-Tyr-Phe-Leu、Tyr-Met-Val-Ser-Ala-Ile-Trp-Gly、Tyr-Tyr-Ile-Val-Ser和Tyr-Tyr-Asp-Pro-Leu抗氧化肽，這些抗氧化肽都表現(xiàn)出了良好的抗氧化活性?？寡趸牡难芯恳恢笔翘烊豢寡趸瘎┭芯恐械臒狳c(diǎn)之一。

目前，關(guān)于羊腦蛋白的研究尚少，羊腦的利用價(jià)值也沒有得到深入的開發(fā)，市場(chǎng)所售羊腦的價(jià)格僅為10 元/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于羊肉的價(jià)格。本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化羊腦蛋白的酶解工藝條件，并研究羊腦蛋白酶解產(chǎn)物的體外抗氧化活性，旨在為羊腦深加工和功能產(chǎn)品開發(fā)，提高羊腦加工利用效益提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

羊腦由陜西楊凌華興羊產(chǎn)業(yè)科技發(fā)展有限公司提供，羊品種為陜北絨山羊。

枯草芽孢桿菌中性蛋白酶、胃蛋白酶 北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶 美國(guó)Amresco公司；木瓜 蛋白酶 西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；菲洛嗪、阿拉丁試劑、抗壞血酸 成都市科龍化工試劑廠；石油醚、氫氧化鈉、鹽酸、95%乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、亞硝酸鈉、鄰苯三酚、茚三酮等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

LGJ-100型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)儀器公司；索氏提取器 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；UV-2550型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；JYL-CO12九陽料理機(jī)九陽股份有限公司；HH-4恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；HC-3018高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1脫脂羊腦蛋白粉的制備

將取回的新鮮羊腦用自來水清洗去除表面雜質(zhì)和鮮血，于-60 ℃條件下冷凍24 h，之后于9.5 Pa，-40 ℃條件下冷凍干燥48 h，凍干后的羊腦經(jīng)九陽料理機(jī)粉碎30 s過100 目篩，用濾紙包裹后放入索氏提取器中用石油醚脫脂12 h，脫脂后的羊腦分散于玻璃紙上于通風(fēng)櫥放置24 h充分揮發(fā)殘留的石油醚。然后再用九陽料理機(jī)粉碎30 s過100 目篩，用自封袋包裝后于-60 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2脫脂羊腦蛋白酶解工藝流程

脫脂羊腦粉→按比例加蒸餾水混勻→調(diào)節(jié)pH值→保溫酶解→沸水滅酶10 min→5 400 r/min離心10 min→取上清液得到酶解液。

1.3.3脫脂羊腦蛋白水解蛋白酶的選擇

稱取0.5 g脫脂羊腦蛋白粉于100 mL燒杯中，加入15 mL蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，?.1 mol/L氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)至各水解蛋白酶的最適pH值，按照加酶量為4 000 U/g脫脂羊腦蛋白粉的比例分別加入枯草芽孢桿菌中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶，分別置于各自最適水解溫度下水解2 h，各蛋白酶的水解條件見表1。酶解結(jié)束后，沸水浴滅酶10 min，5 400 r/min離心10 min后，取上清液測(cè)定各酶解液的水解度，根據(jù)水解度高低選擇水解效果較好的蛋白酶作為最適的脫脂羊腦蛋白水解酶。

表1　不同蛋白酶水解實(shí)驗(yàn)條件Table1 Experimental conditions for different proteases

1.3.4枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解脫脂羊腦蛋白的單因素試驗(yàn)

1.3.4.1底物質(zhì)量濃度對(duì)枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解羊腦蛋 白水解度的影響

以優(yōu)選的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶為水解酶，在水解時(shí)間為2 h，加酶量為4 000 U/g，酶解溫度為40 ℃，pH 7.0的條件下，選取脫脂羊腦蛋白底物質(zhì)量濃度分別為1、2、3、4、5 g/100 mL，研究底物質(zhì)量濃度對(duì)中性蛋白酶水解羊腦蛋白水解度的影響，以水解度最大者做為最適酶解脫脂羊腦蛋白的底物質(zhì)量濃度。

1.3.4.2酶解溫度對(duì)枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解羊腦蛋白水解度的影響

以優(yōu)選的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶為水解酶，在底物質(zhì)量濃度3 g/100 mL，加酶量4 000 U/g，pH 7.0條件下，分別選取酶解溫度為30、35、40、45、50 ℃，水解2 h，研究酶解溫度對(duì)枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解羊腦蛋白水解度的影響，以水解度最大者優(yōu)選出最適酶解溫度。

1. 3.4.3 酶添加量對(duì)枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解羊腦蛋白水解度的影響

以優(yōu)選的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶為水解酶，在底物質(zhì)量濃度為3 g/100 mL，酶解溫度為40 ℃，pH 7.0條件下，選取酶添加量分別為2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 U/g，水解2 h，研究酶添加量對(duì)枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解羊腦蛋白水解度的影響，以水解度最大者優(yōu)選出最適酶用量。

由于枯草芽孢桿菌中性蛋白酶酶解pH值已經(jīng)由試劑公司給出，故未將pH值作為工藝優(yōu)化的因素進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.5響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解脫脂羊腦蛋白條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理。 以 酶解溫度、底物質(zhì)量濃度、酶添加量為自變量，蛋白質(zhì)水解度為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析采用Desigh-Expert 7.0 Trial軟件。

1.3.6脫脂羊腦蛋白水解度與酶解產(chǎn)物抗氧化活性關(guān)系研究

在優(yōu)化的條件下，取0.5 g脫脂羊腦粉，加蒸餾水混勻，調(diào)節(jié)pH 7.0，加適量枯草芽孢桿菌中性蛋白酶，分別酶解1、2、3、4、5、6、7 h，利用酶解時(shí)間控制羊腦蛋白水解度，之后離心，取上清液，對(duì)所得的酶解液進(jìn)行水解度測(cè)定和抗氧化能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)，以不酶解羊腦蛋白上清液做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，研究羊腦不同水解度與抗氧化活性之間的關(guān)系，選擇出抗氧化性最強(qiáng)的酶水解度。

1.3.7脫脂羊腦蛋白水解度（degree of hydrolysis，DH）的測(cè)定

采用茚三酮法測(cè)定酶解液的水解度［3-4］。

1.3.8脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的測(cè)定

1.3.8.1脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自 由基清除率的測(cè)定［5］

用95%乙醇將DPPH配制成0.1 mmol/L的溶液，取2 mL DPPH乙醇溶液置于不同試管中，分別加入2 mL脫脂羊腦蛋白酶解液和不同濃度的VC溶液試樣，振蕩混勻，于室溫下暗反應(yīng)30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，分別以蒸餾水代替試樣和DPPH乙醇溶液做空白實(shí)驗(yàn)，DPPH自由基清除率按公式（1）計(jì)算，比較脫脂羊腦蛋白酶解液與VC對(duì)DPPH自由基清除效果。

式中：As為試樣與DPPH乙醇溶液反應(yīng)吸光度；A0為9 5%乙醇代替DPPH乙醇溶液的對(duì)照吸光度；Ab為蒸餾水替代試樣的空白吸光度。

1.3.8.2脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物總還原能力的測(cè)定［6］

分別取1 mL脫脂羊腦蛋白水解液或不同濃度VC溶液于試管中，分別加入2.5 mL、0.2 mol/L pH 6.6磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1 g/100 mL的鐵氰化鉀溶液，充分混勻，于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min，冷卻至室溫，再分別加入2.5 mL 10 g/100 mL的三氯乙酸溶液，振蕩后，3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，依次分別加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1 g/100 mL三氯化鐵溶液，充分振蕩，室溫靜置10 min，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，用吸光度大小表示檢測(cè)試樣的總還原力大小。比較脫脂羊腦蛋白水解液與VC的總還原能力。

1.3.8.3脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)·OH清除率測(cè)定［7］

先在不同試管中加入1 mL 0.15 mol/L的硫酸亞鐵溶液和1 mL 2 mmol/L水楊酸鈉溶液，然后分別加入1 mL脫脂羊腦蛋白酶解液或不同濃度VC溶液試樣，再分別 加入1 mL 6 mmol/L過氧化氫溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，于37 ℃反應(yīng)1 h后，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。分別以蒸餾水替代試樣和過氧化氫溶液做空白對(duì)照，·OH清除率按公式（2）計(jì)算，比較脫脂羊腦蛋白水解液與VC對(duì)·OH清除效果。

式中：As為試樣的吸光度；A0為蒸餾水替代過氧化氫的對(duì) 照吸光度；Ab為蒸餾水替代試樣的空白吸光度。

式中：As為試樣吸光度；A0為蒸餾水替代鄰苯三酚溶液的對(duì)照吸光度；Ab為蒸餾水替代試樣的空白吸光度。1.3.8.5 脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)亞硝酸根陰離子清除能力測(cè)定［9-10］

取1 mL酶解液或不同濃度VC溶液于不同試管中，分別加入l mL 5 μg/mL亞硝酸鈉溶液，于37 ℃條件下反應(yīng)30 min，再分別加入l mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%對(duì)氨基苯磺酸，搖勻靜置5 min；再分別加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%鹽酸萘乙二胺顯色劑，搖勻，靜置反應(yīng)15 min，于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。分別以蒸餾水替代試樣和亞硝酸鈉溶液做空白實(shí)驗(yàn)，亞硝酸根陰離子清除率按公式（4）計(jì)算，比較脫脂羊腦蛋白水解液與VC對(duì)亞硝酸根陰離子清除效果。

式中：As為試樣吸光度；A0為蒸餾水替代亞硝酸鈉溶液對(duì)照吸光度；Ab為蒸餾水替代試樣空白吸光度。

1.3.8.6脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)亞鐵離子螯合能力測(cè)定［11］

取3 mL脫脂羊腦蛋白酶解液或不同濃度乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）溶液試樣于不同試管中，分別加入0.1 mL 0.2 mmol/L氯化亞鐵溶液，混合均勻，反應(yīng)3 min，分別加入0.2 mL 5 mmol/L的菲洛嗪溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，劇烈振蕩于室溫放置10 min，在562 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。分別以蒸餾水替代試樣和氯化亞鐵溶液做空白實(shí)驗(yàn)，亞鐵離子螯合率按公式（5）計(jì)算，比較脫脂羊腦蛋白 水解液與EDTA-2Na對(duì)亞鐵離子的螯合效果。

式中：As為試樣吸光度；A0為蒸餾水替代氯化亞鐵溶液的對(duì)照吸光度；Ab為蒸餾水替代試樣空白吸光度。

以上抗氧化能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，除了亞鐵離子螯合能力測(cè)定用EDTA-2Na做陽性對(duì)照外，其余抗氧化實(shí)驗(yàn)以VC做陽性對(duì)照，用以考察酶解液的抗氧化活性強(qiáng)弱。

2　結(jié)果與分析

2.1脫脂羊腦蛋白水解酶選擇

圖1　蛋白 酶種類對(duì)脫脂羊腦蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of enz yme type on the deg ree of hydrolysis （DH） of goat brain protein

由圖1可知，枯草芽孢桿菌中性蛋白酶對(duì)脫脂羊腦蛋白的水解效果最好，水解度為（12.39±0.72）%，其次是胃蛋白酶、木瓜蛋白酶，胰蛋白酶水解效果最差。說明枯草芽孢桿菌中性蛋白酶對(duì)脫脂羊腦蛋白水解較為徹底，能得到大量羊腦蛋白水解的小分子肽。Chalamaiah等［12］對(duì)魚卵蛋白水解制備抗氧化肽的研究結(jié)果表明，大分子質(zhì)量蛋白經(jīng)水解后所得的小分子質(zhì)量多肽具有更強(qiáng)的抗氧化性，所以選擇枯草芽孢桿菌中性蛋白酶作為脫脂羊腦蛋白水解的蛋白酶。

2.2枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解脫脂羊腦蛋白的單因素試驗(yàn)

由圖2可知，脫脂羊腦蛋白水解度呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)脫脂羊腦蛋白質(zhì)量濃度為3 g/100 mL時(shí)，水解度達(dá)到最大。出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能是因?yàn)樵谒饷笣舛纫欢l件下，當(dāng)脫脂羊腦蛋白質(zhì)量濃度小于3 g/100 mL時(shí)，隨著其質(zhì)量濃度的增加，蛋白酶與脫脂羊腦蛋白的接觸幾率增加，水解蛋白較為徹底，因而導(dǎo)致水解度升高；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度大于3 g/100 mL時(shí)，酶濃度成為影響酶解效果的主要因素，隨著脫脂羊腦蛋白質(zhì)量濃度繼續(xù)增加時(shí)，酶濃度逐漸不足而導(dǎo)致蛋白水解不徹底。因此在其他水解條件一定時(shí)，脫脂羊腦蛋白質(zhì)量濃度為3 g/100 mL時(shí)，水解效果最好，因此底物質(zhì)量濃度選為2～4 g/100 mL。

圖2　底物質(zhì)量濃度對(duì)脫脂羊腦蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on the degree of hydrolysis （DH）of goat brain protein

圖3　酶解溫度對(duì)脫脂羊腦蛋白水解度的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis （DH）of goat brain protein

由圖3可知，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著酶解溫度的升高，脫脂羊腦蛋白水解度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度為40 ℃時(shí)，水解度達(dá)到最大。枯草芽孢桿菌中性蛋白酶的最適酶解溫度是40 ℃，當(dāng)溫度偏離最適工作溫度越遠(yuǎn)，酶解效果越差。因此最優(yōu)水解溫度選為35～45 ℃。

圖4　酶添加量對(duì)脫脂羊腦蛋白水解度的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on the degree of hydrolysis （DH） of goat brain protein

由圖4可知，隨著酶添加量的增加，脫脂羊腦蛋白水解度也不斷升高，當(dāng)酶添加量達(dá)到5 000 U/g時(shí)，水解度升高不再明顯，因此酶添加量選為4 000～6 000 U/g。

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化脫脂羊腦蛋白枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解條件

表2　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table2 Box-Behnken design and results

表3　響應(yīng)面二次模型方差分析Table3 Analysis of variance for the fitted quadratic regression model

響應(yīng)面法優(yōu)化脫脂羊腦蛋白中性蛋白酶水解試驗(yàn)結(jié)果見表3，通過Design-Expert 7.0軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表4?；貧w方程R2=0.979 4，說明該模型方程有很好的精密度，回歸效果較好，可信度高?；貧w方程模型達(dá)到極顯著水平（P＜ 0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說明該模型有較好的擬合效果?；貧w系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表明，因素X1、對(duì)蛋白水解度的影響達(dá)到極顯著水平；因素X2、X1X2、對(duì)蛋白水解度的影響達(dá)到顯著水平。由主效應(yīng)P值可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)各因素對(duì)脫脂羊腦蛋白酶解水解度影響程度大小依次為酶添加量X3＞酶解溫度X1＞底物質(zhì)量濃度X2。以酶解溫度（X1）、底物質(zhì)量濃度（X2）、酶添加量（X3）為自變量 ，脫脂羊 腦蛋白水解度Y為響應(yīng)值， 經(jīng)回歸擬合后，得到回歸方程：

圖5　酶解溫度、底物質(zhì)量濃度和酶添加量交互作用影響水解度的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots indicating the effects of three hydrolysis parameters on degree of hydroly sis （DH）

由圖5可知，當(dāng)酶添加量為4 000 U/g時(shí)，水解度隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度 處于低水平時(shí)，水 解度隨著溫度升高變化較大，而當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度處于高水平時(shí)，水解度隨著溫度升高變化較??； 水解度隨底物質(zhì)量濃度的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度處于低水 平時(shí)，水解度隨著底物質(zhì)量濃度升高變化較小， 而當(dāng)酶解溫度處于高水平時(shí)，水解度隨著底物質(zhì)量濃度升高變化較大。當(dāng)酶解溫度為40 ℃、酶添加量處于低水平時(shí)，水解度隨著底物質(zhì)量濃度升高而增大，當(dāng)酶添加量處于高水平時(shí)，水解度隨著底物質(zhì)量濃度升高先增大后減小。

通過Design-Expert 7.0軟件分析確定出脫脂羊腦蛋白的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶最佳酶水解工藝條件為：酶解溫度39.4 ℃，底物質(zhì)量濃度3.03 g/100 mL，酶添加量5 653.20 U/g，此時(shí)得到的水解度預(yù)測(cè)值為14.79%。根據(jù)所得的分析數(shù)據(jù)進(jìn)行3 組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到最佳水解度實(shí)際值為（14.59±1.26）%，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果偏差不大，證明該回歸模型具有良好的預(yù)測(cè)意義。

2.4脫脂羊腦蛋白水解度與酶解產(chǎn)物抗氧化活性關(guān)系

蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶水解后可形成具有一定功能特性的小分子肽段，但并不是水解度越高，多肽的功能性越強(qiáng)，當(dāng)水解過度時(shí)，多肽的功能性會(huì)降低或消失［13］。因此，本實(shí)驗(yàn)在酶水解優(yōu)化試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過水解時(shí)間來控制羊腦蛋白水解度，研究羊腦蛋白水解度與酶解產(chǎn)物的抗氧化能力之間的關(guān)系。

圖6　酶解產(chǎn)物水解度與抗氧化活性的關(guān)系Fig.6 Relationship between DH and antioxidant activities of hydrolysates

由圖6可知，枯草芽孢桿菌中性蛋白酶對(duì)脫脂羊腦蛋白的水解度隨水解時(shí)間延長(zhǎng)不斷升高。由圖6a可知，隨著脫脂羊腦蛋白水解度的增大，酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除率先增加，當(dāng)脫脂羊腦蛋白用中性蛋白酶水解4 h，水解度達(dá)到（14.39±1.17）%時(shí)，酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到最 大值，而后酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率隨水解度升高而降低。由圖6b可知，脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)O2-?清除率隨蛋白水解度增加先增加后降低，當(dāng)脫脂羊腦蛋白水解3 h，水解度為（12.48±0.71）%時(shí)，對(duì)O2-?清除率達(dá)到最大值。由圖6c可知，脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)?OH清除率隨蛋白水解度增加先增加后降低，當(dāng)脫脂羊腦蛋白水解4 h，水解度為（14.39±1.17）%時(shí)，對(duì)?OH清除率達(dá)到最大值。由圖6d可知，脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物的總還原力隨蛋白水解度增加先增加后降低，當(dāng)脫脂羊腦蛋白水解3 h，水解度為（12.48±0.71）%時(shí)，酶解產(chǎn)物的總還原力達(dá)到最大值。

由于酶解3 h與酶解4 h所得酶解液的抗氧化能力差別不大，在考慮到節(jié)約時(shí)間的情況下，酶解時(shí)間確定為3 h。由圖6可知，酶解4 h以上，酶解液的抗氧化能力逐漸減弱，原因是原 有的功能性肽段在繼續(xù)水解過程中因過度水解為分子質(zhì)量更小的片段而失去了原有的活性，這與Klompong等［14］得到的過度水解會(huì)減弱多肽的抗氧化活性和其他功能特性的結(jié)論是一致的。

另外，當(dāng)脫脂羊腦蛋白未經(jīng)水解時(shí)，其產(chǎn)物的抗氧化活性明顯低于酶解之后酶解液的抗氧化性，原因是酶解過程中，蛋白酶將一些大分子的羊腦蛋白水解為具有抗氧化活性的小分子多肽。由此可知，經(jīng)過酶解后的脫脂羊腦蛋白酶解液比未經(jīng)酶解的脫脂羊腦蛋白具有更強(qiáng)的抗氧化性。

2.5脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性

圖7　不同質(zhì)量濃度酶解產(chǎn)物與對(duì)照的抗氧化活性Fig.7 Comparisons of antioxidant activities between hydrolysates and contr ol at different concentrations

不同質(zhì)量濃度酶解產(chǎn)物及其對(duì)照的抗氧化能力如圖7所示。由圖7a、7b可知，脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物表現(xiàn)出了一定的DPPH自由基清除能力，當(dāng)酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度小于3 mg/mL時(shí)，清除率與酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度大于3 mg/mL時(shí)，隨著其質(zhì)量濃度 的增大，清除率的變化率降低。通過方程計(jì)算可得，VC和酶解產(chǎn)物 對(duì)DPP H自由基的IC50分別為0.049 mg/mL和2.49 mg/mL，酶解產(chǎn)物IC50值為VC的50.82 倍，說明脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于VC，但高于Klomklao等［15］制得的鯰魚蛋白酶解產(chǎn)物（酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，清除率 小于20%）、Naqash等［16］制得的金線魚蛋白 酶解產(chǎn)物（酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度為3 mg/mL時(shí)，清除率為48%）和Venuste等［17］制得的南瓜蛋白酶解產(chǎn)物（當(dāng)酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度為3 mg/mL時(shí)，清除率小于50%），由此說明，相 對(duì)于其他抗氧化肽而言，脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

由圖7c、7d可知，脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)?OH的清除率隨著其質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，并且呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，由圖中的回歸方程計(jì)算可知，VC和酶解產(chǎn)物對(duì)?OH的IC50分 別為0.15 mg/mL和3.13 mg/mL。羊腦 蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)?OH的清除能力低于VC，但高于Zhuang Hong等［5］制得的玉米蛋白酶解產(chǎn)物（酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，清除率為50.76%）和楊露等［18］制備的馬面魚骨膠原多肽（多肽質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，清除率小于50%），由此說明，相對(duì)于其他酶解產(chǎn)物而言，脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的清除?OH的能力。

由圖7g、7h可知，脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物具有清除亞硝酸鹽的能力，對(duì)亞硝酸鹽的清除率隨著其質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，并且呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系，由回歸方程計(jì)算可 知，VC和酶解產(chǎn)物對(duì)亞硝酸鹽的IC50分別為0.03 mg/mL 和10.89 mg/mL。雖 然脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物具有一定清除亞硝酸鹽的能力，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于VC。

由圖7i、7j可知，脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物有一定螯合亞鐵離子的能力，對(duì)亞鐵離子的螯合率隨其質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，由回歸方程計(jì)算可知，EDTA-2Na和酶解產(chǎn)物對(duì)亞鐵離子的IC50分別為16.35 ?g/mL和7.48 mg/mL。脫脂羊腦蛋白酶解物對(duì)亞鐵離子的清除能力不僅遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于EDTA-2Na，且與Naqash等［16］制得的金線魚蛋白酶解產(chǎn)物（酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度為3 mg/mL時(shí)，清除率大于60%）、Chalamaiah等［12］制得的南亞野陵卵蛋白酶解產(chǎn)物（酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時(shí)，清除率為56.80%）、Memarpoor-Yazdi等［1］制得的棗蛋白酶解產(chǎn)物（酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，清除率為21.60%）相比，脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物的亞鐵離子螯合能力也較弱。

3　結(jié) 論

脫脂羊腦蛋白最適水解酶為枯草芽孢桿菌中性蛋白酶。在底物質(zhì)量濃度為3.03 g/100 mL，酶添加量為5 653. 20 U/g底物，水解溫度為39.4 ℃，pH 7.0時(shí)，脫脂羊腦蛋白的水解度最高，可達(dá)（14.59±1.26）%。

當(dāng)脫脂羊腦蛋白水解度為（14.39±1.17）%時(shí)，酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基和?OH清除能力最強(qiáng)；當(dāng)脫脂羊腦蛋白水解度為（12.48±0.71）%時(shí) ，酶解產(chǎn)物對(duì)清除能力最強(qiáng)且總還原能力最強(qiáng)；當(dāng)脫脂羊腦蛋白水解度為（12.48±0.71）%時(shí)，酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基、?OH、、亞硝酸根陰離子的半數(shù)抑制率IC50分別為2.49、3.13、10.37、10.89 mg/mL，對(duì)Fe2+螯合率的IC50為7.48 mg/mL。

脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化能力遠(yuǎn)低于VC或EDTA-2Na，與其他酶解制備抗氧化肽相比，脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物具有較強(qiáng)清除DPPH自由基、?OH和O2-?能力，但螯合亞鐵離子能力上低于其他酶解制備的抗氧化肽。

［1］ MEMARPOOR-YAZDI M， MAHAKIA H， ZARE-ZARDINIB H. Antioxidant activity of protein hydrolysates and purified peptides from Zizyphus jujuba fruits［J］. Journal of Functional Foods， 2013， 5（1）: 62-70.

［2］ 張苗. 甘薯蛋白酶解肽的抗氧化及結(jié)腸癌活性研究［D］. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2012.

［3］ 包怡紅， 于陽陽， 趙若詩(shī). 酶解山核桃蛋白制備降血壓肽的工藝［J］.食品科學(xué)， 2013， 34（1）: 220-224.

［4］ 蔣婧. 蛋白質(zhì)水解度測(cè)定及其標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制研究［J］. 廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2012， 11（1）: 4-6.

［5］ ZHUANG Hong， TANG Ning， YUAN Yuan. Purification and identification of antioxidant peptides from corn gluten meal［J］. Journal of Functional Foods， 2013， 5（4）: 1810-1821.

［6］ 張澤生， 賀偉， 劉甜甜， 等. 白藜蘆醇的體外抗氧化活性［J］. 食品科學(xué)， 2012， 33（11）: 266-268.

［7］ 侯學(xué)敏， 李林霞， 張直峰， 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化薄荷葉總黃酮提取工藝及抗氧化活性［J］. 食品科學(xué)， 2013， 34（6）: 124-128.

［8］ 樸美子， 王懋存， 王曉東. 中華真地鱉酶解短肽的抗氧化作用［J］. 食品科學(xué)， 2013， 34（5）: 242-245.

［9］ 郭剛軍， 彭春秀， 何享， 等. 云南曬青毛茶提取物抗氧化活性研究［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2013， 13（8）: 42-48.

［10］ 付曉燕， 李海龍， 楊超， 等. 發(fā)芽燕麥不同溶劑提取液抗氧化活性的比較［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2011， 37（4）: 68-72.

［11］ WANG Mingchun， ZHU Peilei， JIANG Changxing， et al. Preliminary characterization， antioxidant activity in vitro and hepatoprotective effect on acute alcohol-induced liver injury in mice of polysaccharides from the peduncles of Hovenia dulcis［J］. Food and Chemical Toxicology， 2012， 50（9）: 2964-2970.

［12］ CHALAMAIAH M， JYOTHIRMAYI T， BHASKARACHARY K， et al. Chemical composition， molecular mass distribution and antioxidant capacity of rohu roe （egg） protein hydrolysates prepared by gastrointestinal proteases［J］. Food Research International， 2013， 52（1）: 221-229.

［13］ INTARASIRISAWAT R， BENJAKUL S， VISESSANGUAN W， et al. Antioxidative and functional properties of protein hydrolysate from defatted skipjack roe［J］. Food Chemistry， 2012， 135（4）: 3039-3048.

［14］ KLOMPONG V， BENJAKUL S， KANTACHOTE D， et al. Antioxidative activity and functional properties of protein hydrolysate of yellow stripe trevally as influenced by the degree of hydrolysis and enzyme type［J］. Food Chemistry， 2007， 102（4）: 1317-1327.

［15］ KLOMKLAO S， BENJAKUL S， KISHIMURA H. Functional properties and antioxidative activity of protein hydrolysates from toothed ponyfish muscle treated with viscera extract from hybrid catfish［J］. International Journal of Food Science & Technology， 2013，48（7）: 1483-1489.

［16］ NAQASH S Y， NAZEER R A. Antioxidant and functional properties of protein hydrolysates from pink perch （Nemipterus japonicus） muscle［J］. Journal of Food Science and Technology， 2013， 50（5）: 972-978.

［17］ VENUSTE M， ZHANG X， SHOEMAKER C F， et al. Influence of enzymatic hydrolysis and enzyme type on the nutritional and antioxidant properties of pumpkin meal hydrolysates［J］. Food & Function， 2013， 4（5）: 811-820.

［18］ 楊露， 丁利君， 藍(lán)德安. 馬面魚骨膠原多肽的理化特性及其抗氧化活性［J］. 食品科學(xué)， 2013， 34（7）: 234-239.

［19］ 傅亮， 何倩， 陳勇， 等. 綠豆多肽的制備工藝及抗氧化作用［J］. 食品與機(jī)械， 2010， 26（6）: 79-82.

Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Goat Brain Protein and Antioxidant Activity of the Resultant Hydrolysates

CHANG Fei1， YANG Xueguo1， XIAO Shicheng2， DUAN Xuchang1，*
（1. College of Food Science and Engineering， Northwest A&F University， Yangling 712100， China；2. Shaanxi Huaxing Goat Industry Science and Technology Development Co. Ltd.， Yangling 712100， China）

The enzymatic hydrolysis parameters of defatted goat brain protein with Bacillus subtilis neutral protease were optimized by response surface methodology. The optimized parameters were determined as fol lows: substrate concentration，3.03 g/100 mL； enzyme/substrate ratio， 5 653. 20 U/g； and hydrolysis temperature， 39.4 ℃. The maximum degree of protein hydrolysis was （14.59±1.26） % with the optimized parameters. The antioxidant activity of the resultant hydrolysates was investigated in vitro. The antioxidant activity presented its maximum value when the hydrolysis degree was （12.48±0.71）%. The IC50of the protein hydrolysates for scavenging 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH）， hydroxyl， superoxide anion， and nitrite radicals were 2.49， 3.13， 10.37 and 10.89 mg/mL， respectively， and the IC50for chelating Fe2+ions was 7.48 mg/mL. These results suggest that the protein hydrolysates possess excellent antioxidant activity.

goat brain protein； enzymatic hydrolysate； response surface methodology； antioxidant activity

TS209

A

1002-6630（2015）03-0114-08

10.7506/spkx1002-6630-201503022

2014-04-23

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD28B05-3）

常飛（ 1987—），男，碩士研究生，主要從事食品加工新技術(shù)研究。E-mail：changfeibest@126.com

段旭昌（1965—），男，副教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物及食品加工新技術(shù)研究。E-mail：duanxc1965@tom.com