高 娜，張玉斌，韓 玲，*，保善科，郭文瑞，余群力

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.青海省海北州畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，青海 海北 812200）

牦牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶提取工藝的優(yōu)化

高 娜1，張玉斌1，韓 玲1，*，保善科2，郭文瑞1，余群力1

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.青海省海北州畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，青海 海北 812200）

為研究牦牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶的最佳提取條件，本實(shí)驗(yàn)以牦牛背最長肌為研究對象，以高鐵肌紅蛋白還原酶活力為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面分析法，以高鐵肌紅蛋白還原酶活力為響應(yīng)值，對磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl和檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液3 種提取液的pH值、濃度和料液比3 個因素進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：各因素對酶活力的影響大小順序依次為提取液的pH值＞料液比＞濃度；最佳提取參數(shù)為磷酸鹽緩沖液pH 7.22、料液比1：2.25（m/V）、濃度 2.12 mmol/L，在此條件下酶活力為73.92 U/L，與理論預(yù)測值的相對誤差為0.86%，說明本實(shí)驗(yàn)所建立的模型在實(shí)踐中具有可行性。

高鐵肌紅蛋白還原酶；牦牛背最長??；提取工藝；響應(yīng)面法

肌細(xì)胞內(nèi)部存在著一系列能將高鐵肌紅蛋白（MetMb）還原為氧合肌紅蛋白（MbO2）的酶，研究者稱之為高鐵肌紅蛋白還原酶（metmyoglobin reductase，MetMbR）［1］。高鐵肌紅蛋白還原酶不是單獨(dú)的一種酶，而是和肉色相關(guān)的一類酶［2-3］，其理化性質(zhì)不穩(wěn)定，很容易在光線和有氧環(huán)境下迅速發(fā)生改變［4］。MetMbR可以阻抗引起肉品褐變的MetMb的積累，從而穩(wěn)定肉色，延長肉品貨架期［5］。

肉色是鮮肉的重要感官特性之一，直接影響消費(fèi)者的購買意愿［6-7］。肉色鮮紅富有光澤表明肉品新鮮、質(zhì)地優(yōu)良，這與肉中肌紅蛋白的數(shù)量和狀態(tài)以及高鐵肌紅蛋白還原酶體系密切相關(guān)［8-11］。肉中MetMbR首次報道于20世紀(jì)60年代初，Dean和Ball在真空包裝的鮮肉表面觀察到MetMb的還原，提出肉中天然還原系統(tǒng)（metmyoglobin reducing system）的存在［12］。隨后有人分別報道了牛骨骼肌、背最長肌和腰大肌、藍(lán)鰭金槍魚肌肉中的酶促反應(yīng)與肉色變化的關(guān)系［13-15］，證實(shí)了Dean和Ball的發(fā)現(xiàn)。Ledward［16］研究認(rèn)為，MetMbR對肉類色澤穩(wěn)定性有決定性作用，研究MetMbR與MetMb的相互作用，需要得到比較理想的MetMbR生物材料作為基準(zhǔn)物，從而提高研究的科學(xué)性和可靠性［8］。盡管對肉中高鐵肌紅蛋白還原酶測定方法的研究報道很多，然而，目前國內(nèi)外對高鐵肌紅蛋白還原酶的研究主要集中在普通牛和豬等畜類上，尚未見針對牦牛背最長肌中高鐵肌紅蛋白酶提取條件優(yōu)化的研究報道，所以，研究高鐵肌紅蛋白酶的提取工藝對實(shí)踐有指導(dǎo)意義。

牦牛生存在我國高海拔低氧環(huán)境中，體內(nèi)肌紅蛋白含量比低海拔地區(qū)的牛種高，而這一特性又導(dǎo)致了其肉色較差，不易被消費(fèi)者接受［17-18］。因此，研究牦牛相關(guān)產(chǎn)品的肉色穩(wěn)定體系，對于提升冷鮮牦牛肉品質(zhì)，擴(kuò)大我國牦牛肉的消費(fèi)市場，開發(fā)中國特色畜種資源都具有極其重要的意義。本研究以牦牛背最長肌為原料，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法，研究3 種提取液對高鐵肌紅蛋白還原酶活力的影響，并確定高鐵肌紅蛋白還原酶的最佳提取條件，旨在為牦牛高鐵肌紅蛋白還原酶的深入研究提供基礎(chǔ)資料，為宰后生鮮牦牛肉的自我護(hù)色及肉色穩(wěn)定性提供理論依據(jù)，為深入研究不同部位肌肉間肉色差異的機(jī)制及肉品學(xué)、運(yùn)動醫(yī)學(xué)和心血管疾病的研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

牦牛背最長肌 臨夏康美牧業(yè)有限公司；馬心肌肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；乙二胺四乙酸二鈉、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、Tris-HCl緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

SP-756P紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；TGL-24MC臺式高速冷凍離心機(jī) 長沙平凡儀器儀表有限公司；AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器公司；Haier立式超低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司。

1.3方法

1.3.1高鐵肌紅蛋白還原酶的提取方法

參照Reddy等［19］的方法并改進(jìn)：將貯存于-80 ℃的背最長肌樣品于4 ℃恒溫恒濕箱解凍至半凍狀態(tài)，除去表皮脂肪和筋膜，切成小塊。準(zhǔn)確稱取10 g樣品加入20 mL冰提取液，4 ℃條件下，經(jīng)組織搗碎機(jī)處理1 min，再用高速組織分散器連續(xù)均質(zhì)處理1 min（10 000×g，4 ℃），均質(zhì)液離心（10 203×g，4 ℃，20 min），得到上清液經(jīng)中速定性濾紙過濾除去脂肪，濾液中氧合肌紅蛋白用稍過量的鐵氰化鉀氧化后，再用冰提取液于4 ℃條件下透析（透析袋截留相對分子質(zhì)量為14 000）24 h，期間換液5 次，為除去過量的高鐵氰化鉀。透析完畢后離心（14 692×g，4 ℃，20 min），取上清液用PBS（2.0 mmol/L，pH 7.0）定容至20 mL，-80 ℃貯藏備用。

1.3.2高鐵肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

將在-20 ℃條件下凍存的肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶于PBS（2.0 mmol/L，pH 7.0）中，用稍過量的鐵氰化鉀氧化，4 ℃條件下先蒸餾水后PBS（2.0 mmol/L，pH 7.0）透析。將高鐵肌紅蛋白溶液濃縮至0.75 mmol/L，用紫外-可見分光光度計(jì)分別測定525、545、565、572 nm波長處的吸光度，并計(jì)算高鐵肌紅蛋白的含量，使其含量高于93%。將高鐵肌紅蛋白溶液在50 ℃水浴加熱10 min，長時間高溫使可能存在的MetMbR失去活性，然后將此高鐵肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液分裝貯藏于-80 ℃冰箱備用。高鐵肌紅蛋白含量測定公式如下。

式中：R1、R2、R3分別是吸光度比值

1.3.3高鐵肌紅蛋白還原酶活力的測定

配制標(biāo)準(zhǔn)高鐵肌紅蛋白還原酶反應(yīng)體系，成分如表1所示，空白對照以去離子水代替NADH，其他反應(yīng)組分不變。

表1　高鐵肌紅蛋白還原酶活性測定的反應(yīng)組分Table1 Reactants used for determination of metmyoglobin reductase activity

反應(yīng)前30 min將各反應(yīng)物置于25 ℃恒溫水浴鍋中，使反應(yīng)體系溫度維持在25 ℃。待體系中加入NADH后啟動反應(yīng)，用紫外-可見分光光度計(jì)在λ=580 nm波長處測定MetMb與MbO2的吸光度，兩者摩爾消光系數(shù)為12×103L/（mol·cm）。MetMbR活力單位定義為：每分鐘每克肉樣被還原1 nmol的MetMb為一個酶活力單位，單位為U。重復(fù)3 次。酶活力計(jì)算見下式。

式中：ΔA為每分鐘吸光度的變化；V為反應(yīng)體系體積/mL；ε為摩爾消光系數(shù)/（L/（mol·cm））；v為樣品體積/mL；l為比色杯光徑/cm；m為樣品的質(zhì)量/g；109為mol換算成nmol。

1.4高鐵肌紅蛋白還原酶提取工藝的單因素試驗(yàn)

1.4.1提取液種類和pH值范圍的確定

分別配制pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，濃度為2.0 mmol/L的PBS，以1：2（m/V）的料液比按照1.3.1節(jié)的操作方法提取高鐵肌紅蛋白還原酶粗酶液，分別測定酶活力。Tris-HCl和檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液的操作同PBS。

1.4.2提取液種類和濃度范圍的確定

分別配制pH值為7.0，濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mmol/L的PBS，以料液比1：2按照1.3.1節(jié)的操作方法提取粗酶液，分別測定酶活力。Tris-HCl和檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液的操作同PBS。

1.4.3提取液種類和料液比范圍的確定

配制pH值為7.0，濃度為2.0 mmol/L的PBS，按照1.3.1節(jié)的操作方法分別以1：1、1：2、1：3、1：4和1：5的料液比提取粗酶液，并測定酶活力。Tris-HCl和檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液的操作同PBS。

1.5高鐵肌紅蛋白還原酶提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取液pH值、濃度和料液比這3 個因素作為多因素交叉組合試驗(yàn)的考察因素，以酶活力為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面中心旋轉(zhuǎn)組合方式對高鐵肌紅蛋白還原酶提取的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，共設(shè)計(jì)20 組試驗(yàn)，每組做3 個平行，利用Design-Expert 8.05對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，以獲得最佳參數(shù)。

1.6數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel和Design Expert進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1提取液種類和pH值對酶活力的影響

圖1　提取液種類和pH值對酶活力的影響Fig.1 Effects of extraction buffer type and pH on metmyoglobin reductase activity

由圖1可知，用PBS提取的粗酶液酶活力大于用Tris-HCl和用檸檬酸-檸檬酸鈉提取的酶液，且在pH值為7.0時達(dá)到最大值，而用Tris-HCl和用檸檬酸-檸檬酸鈉提取的酶液分別在pH 8.0和pH 6.0處酶活力達(dá)到最大值，確定提取緩沖液為PBS。當(dāng)PBS pH值在6.0～7.0范圍內(nèi)時，酶活力隨pH值的增大而增大，當(dāng)pH值大于7.0后，酶活力先減小后略微增大，所以，選擇PBS pH 6.0～8.0作為響應(yīng)面試驗(yàn)的范圍。

2.1.2提取液種類和濃度對酶活力的影響

圖2　提取液種類和濃度對酶活力的影響Fig.2 Effects of extraction buffer type and concentration on metmyoglobin reductase activity

由圖2可知，用PBS提取的粗酶液酶活力大于用Tris-HCl和用檸檬酸-檸檬酸鈉提取的酶液，而且PBS濃度為2.0 mmol/L時酶活力最大，當(dāng)Tris-HCl濃度為1.0 mmol/L時酶活力達(dá)到最大值，檸檬酸-檸檬酸鈉濃度為10.0 mmol/L時有最大酶活力，因此選擇提取緩沖液為PBS，且濃度在2.0 mmol/L左右。酶活力隨PBS的濃度從1.0 mmol/L增大到2.0 mmol/L，當(dāng)濃度超過2.0 mmol/L時酶活力基本穩(wěn)定，所以，選擇PBS濃度1.0～3.0 mmol/L作為響應(yīng)面試驗(yàn)的范圍。

2.1.3提取液種類和料液比對酶活力的影響

圖3　提取液種類和料液比對酶活力的影響Fig.3 Effects of extraction buffer type and solid-to-solvent ratio on metmyoglobin reductase activity

由圖3可知，結(jié)果與圖1和圖2一致，用PBS提取的粗酶液酶活力大于用Tris-HCl和用檸檬酸-檸檬酸鈉提取的酶液，且當(dāng)料液比為1：2時酶活力高于其他。當(dāng)樣品與PBS的比例從1：1減小到1：2時，酶活力明顯增大，當(dāng)料液比小于1：2后，酶活力逐漸減小，但變化不明顯。所以，選擇料液比1：1～1：3為響應(yīng)面試驗(yàn)范圍。

2.2響應(yīng)面分析法對提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1回歸方程及方差分析

對提取液pH值（A）、濃度（B）和料液比（C）進(jìn)行了三因素三水平響應(yīng)面分析，高鐵肌紅蛋白還原酶提取緩沖液的三因素二次回歸旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表2　響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table2 Response surface design with experimental values of metmyoglobin reductase activity

表3　中心組合試驗(yàn)回歸模型方差分析Table3 Analysis of variance for the fitted regression model

使用Design-Expert 8.05對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到回歸模型方程為Y=74.06+2.23A+1.31B+1.35C-0.23AB+1.46AC+0.17BC-5.85A2-5.27B2-3.36C2。由表3可知，該模型在α=0.01的水平上高度顯著，提取液pH值和料液比的一次項(xiàng)（A、C），提取液pH值、濃度、料液比的二次項(xiàng)（A2、B2、C2）對高鐵肌紅蛋白還原酶活力的影響均極顯著（P＜0.01），緩沖液pH值和料液比的交互作用對酶活力有顯著影響（P＜0.05）。決定系數(shù)R2為0.977 7，說明模型的擬合度好，酶活力的實(shí)際值與預(yù)測值之間具有較好的擬合相關(guān)性。方差分析表明，參試因子對高鐵肌紅蛋白還原酶活力的影響大小順序?yàn)椋禾崛∫旱膒H值＞料液比＞提取液濃度。

2.2.2響應(yīng)面分析及最佳工藝參數(shù)的確定

圖4　高鐵肌紅蛋白還原酶活力響應(yīng)面分析Fig.4 Response surface plots for metmyoglobin reductase activity

對提取緩沖液pH值（A）、濃度（B）、料液比（C）3 個因素兩兩交互作用進(jìn)行分析，做出相應(yīng)的響應(yīng)面曲面，如圖4所示。響應(yīng)面能夠直觀地反映各試驗(yàn)因子對響應(yīng)值影響的大小，并通過等高線圖得最優(yōu)條件下各試驗(yàn)因子的取值。響應(yīng)曲面坡度陡峭表明高鐵肌紅蛋白還原酶的活力對試驗(yàn)因子的改變敏感；反之，則表明酶活力的大小受試驗(yàn)因子的影響小。等高線越密集且越趨向橢圓形表示兩因素交互作用顯著，反之則表明交互作用不顯著。料液比與提取液pH值的響應(yīng)曲面坡度陡峭并且等高線扁而密集，說明酶活力受提取緩沖液pH值與料液比兩因素間的交互作用趨勢比較明顯；提取液濃度與pH值及料液比與提取液濃度交互作用的等高線則相對較圓，說明緩沖液pH值與濃度、料液比與濃度之間的交互作用不顯著，該結(jié)果與表3的方差分析結(jié)果一致。

通過對回歸模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，得出牦牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶提取的最佳工藝參數(shù)為：PBS pH值為7.22、濃度為2.12 mmol/L、料液比為1：2.25，在此工藝條件下，高鐵肌紅蛋白還原酶活力為74.56 U/L。

2.2.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的可靠性，在PBS pH值為7.22、濃度為2.12 mmol/L、料液比為1：2.25的條件下對牦牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶進(jìn)行提取，實(shí)得其酶活力為73.92 U/L，與理論值相比，相對誤差為0.86%。因此，該模型設(shè)計(jì)合理且結(jié)果有效，得到的最佳提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可以應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。

3　結(jié) 論

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，3 種提取液中磷酸鹽緩沖液的效果最佳。通過響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，各提取因素對高鐵肌紅蛋白還原酶活力的大小順序依次為提取液的pH值＞料液比＞提取液濃度。響應(yīng)面分析法得到的最優(yōu)工藝參數(shù)為：提取液pH 7.22、濃度2.12 mmol/L、料液比1：2.25，該條件下測得酶活力為73.92 U/L，與理論預(yù)測值接近，說明本實(shí)驗(yàn)建立的模型與實(shí)際情況吻合，可作為進(jìn)一步探索牦牛高鐵肌紅蛋白還原酶酶學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)資料。

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Optimization of Extraction Process for Metmyoglobin Reductase from longissimus dorsi Muscle of Yak

GAO Na1， ZHANG Yubin1， HAN Ling1，*， BAO Shanke2， GUO Wenrui1， YU Qunli1
（1. College of Food Science and Engineering， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China；2. Animal Husbandry and Veterinary Institute of Haibei State in Qinghai Province， Haibei 812200， China）

This study aimed to find the optimum extraction conditions for metmyoglobin reductase （MetMbR） from longissimus dorsi muscle of yak. The selection of extraction buffer and the optimization of important extraction parameters for enhanced MetMbR activity were carried out by combined use of single factor method and response surface methodology. PBS buffer was found to be the most suitable for the extraction of MetMbR. The pH and concentration of PBS buffer， and solid-to-solvent ratio were identified as main extraction parameters， and their importance showed a decreasing order of pH ＞ solid-to-solvent ratio ＞ concentration. The optimum extraction conditions were determined as extraction using 2.12 mmol/L PBS buffer （pH 7.22） with a solid-to-solvent ratio of 1:2.25 （m/V）. Under these conditions， the metmyoglobin reductase activity was 73.92 U/L， which coincides with the theoretical value with a relative error of 0.86%. In conclution，the model developed in this study is feasible in practice.

metmyoglobin reductase； longissimus dorsi muscle of yak； extraction process； response surface methodology

TS251.1

A

1002-6630（2015）03-0094-05

10.7506/spkx1002-6630-201503018

2014-03-11

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31260380）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉牛牦牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-38）

高娜（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称饭こ?。E-mail：15294209826@163.com

韓玲（1963—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工。E-mail：hanl@gsau.edu.cn