李 妍， 袁 樂， 張曉杭， 曹 頌， 李偉鋒， 蔣建蘭*

（1.天津大學化工學院制藥工程系，天津　300072；2.天津安仁中醫(yī)醫(yī)院，天津　300193）

復方真元顆粒的提取工藝研究

李 妍1， 袁 樂2， 張曉杭1， 曹 頌1， 李偉鋒1， 蔣建蘭1*

（1.天津大學化工學院制藥工程系，天津300072；2.天津安仁中醫(yī)醫(yī)院，天津300193）

目的 研究及優(yōu)化復方真元顆粒的兩次提取工藝。方法 以液固比和提取時間為自變量，以干膏率、甘草苷含有量、甘草酸含有量的綜合指標作為因變量，采用星點設計-響應面試驗設計法，優(yōu)選兩次提取工藝并進行預測分析。

中藥復方真元顆粒；星點設計；干膏率；甘草苷；甘草酸

復方真元顆粒是天津安仁中醫(yī)院根據20余年臨床經驗，切合腫瘤發(fā)病陰陽失衡、真元受損和氣虛血瘀為證候核心的基礎上，依據甘附湯增擴的有效驗方。方中由熟附子（黑順片）、當歸、甘草等9味中藥組成，具有散壯火、強少火、平陰陽、清熱解毒之功效，臨床主要用于腫瘤的輔助治療，改善腫瘤患者體質，提高機體免疫和生存質量，延長患者壽命。但傳統湯劑有諸多缺點，為使其攜帶和服用方便且能達到相同的藥效，首次將其開發(fā)成為安全有效、質量可控的顆粒劑。本實驗根據處方中每味藥材的化學成分和理化性質，結合實際生產特點，采用星點設計-響應面優(yōu)化法［1-3］，以干浸膏得率及甘草苷和甘草酸的含有量的綜合評分為考察指標，優(yōu)選該制劑的提取工藝。

1　材料

1.1試藥 甘草苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111610-201106）；甘草酸銨對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110731-201116）；乙腈、冰醋酸為色譜純；無水乙醇為分析純。

1.2儀器 Lab Alliance高效液相色譜儀（二元高壓梯度泵SeriesⅢ、自動進樣器As3000、二極管陣列檢測器UV6000LP、柱溫箱OV2001）；AL2004電子分析天平（梅特勒—托利多儀器有限公司）；Alpha 1-2型冷凍干燥機（德國Christ公司）；N-1100型旋轉蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；PTHW型普通恒溫電熱套（上海勒頓實業(yè)有限公司）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；AS-20500BT超聲波清洗機（天津奧特賽恩斯儀器公司）。

2　方法與結果

2.1甘草苷和甘草酸的測定

2.1.1色譜條件 Apollo C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5μm）；流動相為乙腈（A）-1%醋酸水溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，19%A；8～20 min，19%A→33%A；20～25 min，33%A→50%A；25～30 min，50%A→100% A；30～35 min，100%A→19%A；35～40 min，19%A）；檢測波長276 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃；進樣量10μL。

2.1.2對照品溶液的制備 （1）精密稱取甘草苷對照品適量，加70%乙醇溶液制成每1 mL含100μg甘草苷的對照品溶液。（2）精密稱取甘草酸銨對照品適量加70%乙醇溶液制成每1 mL含208μg甘草酸銨的對照品溶液（甘草酸質量=甘草酸銨質量/1.020 7）。

2.1.3干浸膏的制備 按照處方比例稱取藥材，加水煎煮得第1次提取液，濾過，濃縮，冷凍干燥，備用；第1次煎煮所得濾渣加水煎煮得第2次提取液，濾過，濃縮，冷凍干燥，備用。

2.1.4供試品溶液的制備 精密稱取干膏0.075 0 g置于5 mL量瓶中，70%乙醇定容，于40℃下超聲混勻40 min，0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為甘草苷和甘草酸的供試品溶液。

2.1.5陰性對照溶液的制備 按處方比例按“2.1.3”項下方法制備缺甘草的陰性對照溶液。

2.1.6專屬性試驗 按“2.1.1”項下色譜條件進樣，分別測定對照品、供試品及陰性對照溶液，結果見圖1。

2.1.7線性范圍考察 精密稱取5份質量成倍數的干膏，依照“2.1.4”項下方法，制備供試品溶液，在“2.1.1”項下色譜條件下進行測定，記錄峰面積。以供試品溶液質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得回歸方程為Y甘草苷= 8×108X+483 531（r=0.998 1），Y甘草酸=9×107X+36 992（r=0.999 3），試驗結果表明甘草苷質量濃度在16.42～169.9μg/mL，甘草酸質量濃度在0.344～3.562μg/mL范圍內具有良好的線性關系。

圖1　干浸膏中成分測定HPLC圖譜

2.1.8精密度試驗 按“2.1.1”項下色譜條件，同一供試品溶液連續(xù)進樣6次，甘草苷和甘草酸峰面積的RSD值分別為1.3%和2.4%，表明精密度良好。

2.1.9穩(wěn)定性試驗 按“2.1.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣，甘草苷和甘草酸峰面積的RSD分別為1.3%和1.0%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.1.10重復性試驗 按“2.1.4”項下方法重復制備供試品溶液6份，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，甘草苷和甘草酸峰面積的RSD分別為0.9%和1.2%，表明該測定方法重復性良好。

2.1.11加樣回收率試驗 取相當于干浸膏0.037 5 g的供試品細粉，平行稱定9份，分別置于5 mL量瓶中，按樣品中成分含有量80%、100%、120%的比例加入甘草苷和甘草酸對照品各3份，依照“2.1.4”項下方法制備供試品溶液。按“2.1.1”項下色譜條件進樣，測定峰面積，由回歸方程計算甘草苷和甘草酸量和回收率，甘草苷和甘草酸的平均回收率分別為97.1%和102.6%，RSD值分別為1.9%和2.1%，表明該方法準確度良好。

2.1.12樣品測定 取干膏適量，平行取樣兩份，按“2.1.4”項下制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，測定，以外標一點法計算干膏中甘草苷、甘草酸的量，與原藥材的比值即為含量。

2.2干膏率的測定 精密稱定一定量的浸膏，冷凍干燥36 h至恒定質量［4］，置于干燥器中30 min恢復至室溫，迅速精密稱定質量，按照下式計算干膏率：

2.3提取工藝優(yōu)選

2.3.1因素及水平考察 根據星點設計試驗原理、預試驗結果和實際生產經驗，結合本處方藥材的特性，采取水煎提取法，提取次數為兩次，每次的考察因素分別為提取時間和液固比。根據星點設計的原理，每因素設五水平，用代碼值-α，-1，0，1，α表示，分析因素及水平見表1和表2。

表1　響應面設計第1次提取的因素與水平

表2　響應面設計第2次提取的因素與水平

2.3.2響應面設計 根據星點設計法則，按照“2.1.3”項下干浸膏制備工藝，每次試驗平行兩份，第1、2次提取試驗安排及結果見表3和4。為將所有指標綜合為一個能反映總體效應結果的值，數據處理采用綜合指標（overall desirability，OD）進行直觀分析和方差分析。各指標綜合評分方程：di=Yi/Ai（di為各指標的評分值，Yi為各指標的實測值，Ai為各指標中相應最大值），以干膏率作為篩選的主要指標，規(guī)定其權重系數為0.6，甘草苷和甘草酸的含有量規(guī)定其權重系數分別為0.2、0.2［5-7］。

每次試驗各指標綜合評分方程：

表3　第1次提取試驗數據

表4　第2次提取試驗數據

2.3.3數學模型擬合及方差分析 以OD值為因變量，使用Desgin Expert8.0.6對兩次提取各因素進行二次式擬合，Y1、Y2分別為第1、2次提取的擬合方程：

Y1=-206.039 21+35.319 63 A+49.389 07B+ 0.634 54AB-18.229 03A2-2.180 85B2；Y2=-78.572 22-6.823 63A+37.393 73B+5.680 00AB-25.596 00 A2-2.247 25B2；對擬合的方程進行方差分析，結果見表5和6。

表5　第1次提取的方差分析

表6　第2次提取的方差分析

由方差分析可知，兩次回歸方程的P＜0.05，失擬性檢驗P＞0.05，相關系數r1=0.809 3，r2=0.851 4，說明方程擬合度良好，該模型準確度較好，可以用該模型對試驗結果進行預測。

2.3.4工藝條件優(yōu)化及預測 根據回歸方程，作出相應的響應曲面圖，見圖2和圖3。結果表明，兩次提取的OD值分別在12倍、1 h和10倍、1 h左右達到最大。結合已建立的數學模型，得到一、二最佳的提取時間和液固比分別是1.09 h、11.41倍；0.91 h、9.40倍。結合實際生產，確定兩次提取工藝參數分別為1 h、12倍和1 h、10倍。

圖2　第1次提取的提取時間、液固比及其相互作用對提取工藝的影響

圖3　第2次提取的提取時間、液固比及其相互作用對提取工藝的影響

2.4工藝驗證試驗 依照最佳工藝條件對第1、2次提取進行3次試驗驗證，結果分別為：第1次提取干膏率27.72%，甘草苷1.29 mg/g，甘草酸2.69 mg/g，實際總OD值為94.60，與預測值97.29偏差-2.76%；第2次提取干膏率7.65%，甘草苷0.42 mg/g，甘草酸1.08 mg/g，實際總OD值為93.79，與預測值95.02偏差-1.29%，說明所建立的數學模型具有良好的預測性，可用于該復方提取工藝的優(yōu)化。

3　討論

3.1抗腫瘤中藥真元顆粒原湯劑具有良好的臨床效果，熟附子味辛甘，性大熱，為補助元陽之主藥，有回陽救逆、逐寒燥濕、溫助腎陽之功，為君藥［8］；當歸補血活血，為臣藥；甘草補中益氣，緩急解毒，調和諸藥，解附子之毒為佐藥等［9］?，F代研究表明，附子多糖、當歸多糖、甘草多糖等各味藥材水溶性多糖均有不同程度的抗腫瘤功效［10-12］，故采用水煎提取工藝。

3.2本方中熟附子雖為君藥，但因其活性成分含有量較少，定量測定方法復雜，故采用測定方法較為成熟的有效成分甘草苷、甘草酸作為評價指標，另由于復方成分復雜，有效成分較多，故亦結合干膏率三者共同作為評價指標，采用OD值對指標進行處理，三者權重分別為0.2、0.2、0.6，較為合理。但由于本方藥味較多，試驗評價指標僅為三項，并未結合相關藥效學研究，因此還需進一步完善。

3.3星點設計-響應面法在試驗設計法和結果表達方面較正交試驗設計法和均勻設計法更加優(yōu)良，適宜進行非線性模型擬合，可提高優(yōu)化預測的精確性，更好地體現各因素、指標與效應值的關系［13-14］。因此，本實驗采用星點設計-響應面法優(yōu)化兩次提取工藝，得到最佳條件，為其工業(yè)化生產提供了依據。

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R284.2

B

1001-1528（2015）03-0660-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.046

2014-01-04

國家自然科學基金項目（81102900）

李 妍（1989—），女，碩士生，從事中藥制劑工藝研究。Tel：18222289215，E-mail：lxxxyyyl@163.com

蔣建蘭（1972—），女，博士，副教授，從事中藥現代化研究。Tel：（022）27400388，E-mail：jljiang@tju.edu.cn

結果 結合生產實際確定第1次最佳提取工藝為12倍量水煎煮1 h，第2次最佳提取工藝為10倍量水煎煮1 h。結論優(yōu)化的最佳提取工藝合理可行，適用于工業(yè)化生產。