車環(huán)宇， 劉 明， 朱冰雅， 劉麗薇， 承 偉

（遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧　錦州　121000）

丹參酮ⅡA殼聚糖納米粒的制備及抗腫瘤活性研究

車環(huán)宇， 劉 明， 朱冰雅， 劉麗薇， 承 偉*

（遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧錦州121000）

目的 采用離子膠凝法制備丹參酮ⅡA殼聚糖納米粒，考察其對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性和抗腫瘤活性。方法 以殼聚糖為材料，采用離子膠凝法制備丹參酮ⅡA殼聚糖納米粒，考察其形態(tài)、大小及分散度，測定納米粒藥物包封率及對(duì)納米粒進(jìn)行體外釋放研究。以人肝癌SMMC-7721細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞模型，通過MTT法考察納米粒的細(xì)胞毒性，利用熒光顯微鏡考察納米粒的細(xì)胞攝取情況。結(jié)果 通過實(shí)驗(yàn)得到的納米粒球形度好，分散均勻，平均水合粒徑為（100±11）nm，多分散指數(shù)為0.09，電位為（12.3±0.56）mV。藥物包封率為（82.1±5.1）%，丹參酮ⅡA殼聚糖靶向納米粒體外釋放緩慢，48 h累計(jì)釋放率達(dá)到90%以上?？瞻准{米粒在72 h內(nèi)幾乎不產(chǎn)生細(xì)胞毒性，丹參酮ⅡA殼聚糖納米粒相比于游離藥物在72 h內(nèi)顯示出明顯的細(xì)胞毒性。結(jié)論 相比于游離藥物，丹參酮ⅡA殼聚糖靶向納米粒顯示出明顯的藥物緩釋特征，通過藥物納米化，大大提高了藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的攝取，增加了藥物對(duì)細(xì)胞的敏感性，提高了治療效果，具有廣泛的應(yīng)用前景。

丹參酮ⅡA；納米粒；殼聚糖；釋放；攝取

丹參酮是從中藥丹參（唇形科植物丹參Salυia miltiorrhiza Bge的根）中提取的具有抑菌作用的脂溶性菲醌化合物，其中丹參酮ⅡA是丹參中脂溶性成分的代表［1］。研究表明丹參酮ⅡA具有一定的抗腫瘤活性，在一定程度抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞分化。因此丹參酮ⅡA作為抗腫瘤藥物具有較好的臨床應(yīng)用前景［2］。其作用機(jī)制主要包括抑制端粒酶活性、改變腫瘤細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)、抑制腫瘤DNA合成等因素［3］。體外試驗(yàn)表明，丹參酮ⅡA可將細(xì)胞阻滯在G1/S期，在一定濃度范圍內(nèi)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期而使進(jìn)入S期的細(xì)胞比例減少，抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的DNA合成［4］。丹參酮ⅡA通過上調(diào)p53和Rb的表達(dá)水平，抑制c-myc和c-fos的表達(dá)，從而抑制骨肉瘤細(xì)胞MG-63的生長［5］。另外也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可以通過下調(diào)凋亡抑制因子surivin的水平，導(dǎo)致人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株HCCC-9180的凋亡［6］。臨床上常采用丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液進(jìn)行應(yīng)用，但由于丹參酮生物半衰期短，靜脈注射后全身分布，容易在體內(nèi)被清除，在病灶部位藥物濃度較低，治療效果不理想［7］。因此，開發(fā)一種治療腫瘤的新型丹參酮制劑已經(jīng)成為目前研究的重點(diǎn)。納米粒是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的新一代亞微粒給藥系統(tǒng)，是指粒徑在10～1 000 nm，以天然或合成的高分子材料為載體，將藥物包裹或夾嵌于核中制成的固體膠粒給藥系統(tǒng)，具有可以控制藥物釋放、避免藥物的降解或泄漏以及良好的靶向性等優(yōu)點(diǎn)［8］。特別是在腫瘤的治療中，相比于正常組織中，實(shí)體瘤組織中血管豐富、血管壁間隙較寬、結(jié)構(gòu)完整性差，淋巴回流缺失，造成大分子類物質(zhì)和納米粒具有選擇性高通透性和滯留性，促進(jìn)了納米粒在腫瘤組織的選擇性分布，可以增加藥效并減少系統(tǒng)副作用［9］?；谝陨咸攸c(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選取殼聚糖作為納米粒材料，通過離子膠凝法制備丹參酮ⅡA殼聚糖靶向納米粒，提高丹參酮ⅡA的生物利用度以及延長其在體內(nèi)的滯留時(shí)間，增加藥物在腫瘤細(xì)胞的攝取，提高其抗腫瘤效果。

1　儀器與試藥

1.1儀器 UV-2550型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；ZRS-8G型智能溶出儀（天津大學(xué)無線電廠），JEM-1200EX透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）；Mastersizer2000激光粒度測定儀（英國Malvern公司）；透析袋（MV：1000-3000，美國spectrum公司）XD-101型倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2試藥 殼聚糖（分子質(zhì)量400 kDa，寧波海鑫生物制品有限公司，批號(hào)20070427，脫乙酰度90%）；丹參酮ⅡA對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110766-200918，純度＞98%）；丹參酮ⅡA（批號(hào)20090723，陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司，純度＞95%）；其余試劑（分析純，市售）。

人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞由遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

2　方法與結(jié)果

2.1丹參酮ⅡA殼聚糖納米粒的制備 丹參酮ⅡA殼聚糖納米粒通過離子膠凝法制得［10-12］。具體步驟為取適量殼聚糖溶解于體積質(zhì)量比為0.5%醋酸溶液中震蕩、溶脹過夜。取5 mg丹參酮ⅡA加入適量乙醇使之充分溶解，再加入含50 mg殼聚糖的溶液中。在200 r/min轉(zhuǎn)速攪拌下緩緩滴加離子聚合劑三聚磷酸鈉溶液，直至體系出現(xiàn)明顯的乳光，即得丹參酮ⅡA殼聚糖納米粒，將納米粒進(jìn)行高速離心，12 000 r/min，10 min，用PBS反復(fù)清洗3次，冷凍干燥得凍干粉末。

2.2納米粒形態(tài)表征 將適量納米粒分散于蒸餾水中，超聲5 min。利用激光粒度測定儀測定納米粒的平均粒徑、點(diǎn)位和分散度。取1～2滴納米粒分散液滴加至碳膜銅網(wǎng)上，揮干溶劑，利用透射電子顯微鏡觀察納米粒形態(tài)。

2.3納米粒包封率測定 分別取丹參酮ⅡA對(duì)照品和輔料乙醇稀釋至一定濃度后，在波長260～600 nm掃描，確定270 nm作為丹參酮ⅡA的測定波長，輔料在此波長下沒有吸收。以丹參酮ⅡA的質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)回歸方程A= 0.016 7C+0.145（n=6），r=0.999 9。精密稱取適量丹參酮ⅡA殼聚糖納米粒分散于10 mL乙醇溶液中，在4℃超聲30 min，從而使藥物從納米粒中完全釋放進(jìn)入介質(zhì)中，高速離心，收集上清液，測定藥物在上清液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物濃度，計(jì)算納米粒包封率。

2.4丹參酮ⅡA殼聚糖納米粒釋放率測定 采用恒溫振蕩水浴法測定藥物在不同pH的介質(zhì)中的藥物釋放率。分別精密量取適量冷凍干燥丹參酮ⅡA殼聚糖納米粒和丹參酮ⅡA對(duì)照品置于透析袋中，緊密封口。將透析袋置于具有pH的200 mL磷酸鹽緩沖液中，（37±0.5）℃，緊密封口，放入錐形瓶中。向錐形瓶中加入200 mL磷酸鹽緩沖液（pH7.4），采用恒溫振蕩水浴法，溫度為（37±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為50 r/min。在預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)取液10 mL，0.45μm微孔濾膜過濾，在270 nm測定濾液的紫外吸收，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法計(jì)算丹參酮ⅡA，并向容器內(nèi)補(bǔ)加等溫同體積的溶出介質(zhì)。計(jì)算載藥納米粒在不同時(shí)間的累積釋放百分率。

2.5細(xì)胞培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞SMMC-7721一瓶，棄去原有培養(yǎng)液，加入2 mL無菌PBS快速清洗2次，加入2 mL的胰蛋白酶，反應(yīng)3～5 min，待細(xì)胞變圓變亮有少許細(xì)胞脫落時(shí)，加入血清停止消化。加入培養(yǎng)液緩慢吹打形成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液按1×104個(gè)/mL的密度接種到6孔板中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.6丹參酮ⅡA殼聚糖納米粒的腫瘤細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到5×104個(gè)/mL，分別向6孔板中加入異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記丹參酮ⅡA殼聚糖納米粒與細(xì)胞共孵育，12 h后，用PBS反復(fù)沖洗細(xì)胞3次，洗去未攝取的剩余納米粒，在熒光顯微鏡下觀察納米粒的細(xì)胞攝取情況。

2.7細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞SMMC-7721一瓶，棄去原有培養(yǎng)液，加入2 mL無菌PBS快速清洗兩次，加入2 mL的胰蛋白酶，反應(yīng)3～5 min，待細(xì)胞變圓變亮有少許細(xì)胞脫落時(shí)，加入血清停止消化。加入培養(yǎng)液緩慢吹打形成單細(xì)胞液。用細(xì)胞活力計(jì)數(shù)器將細(xì)胞稀釋成1×106個(gè)/mL，將細(xì)胞加入到96孔板中每孔100μL。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將用培養(yǎng)液稀釋成不同濃度的空白納米粒，原藥和含藥納米粒通過0.22μm微孔濾膜過濾加入細(xì)胞中，共孵育72 h，每孔加入10μL 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，準(zhǔn)備溶解結(jié)晶。每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm處測量各孔的吸光值。采用MTT法來評(píng)價(jià)空白殼聚糖納米粒、丹參酮ⅡA殼聚糖納米粒和丹參酮ⅡA原料藥對(duì)細(xì)胞的毒性。細(xì)胞的活力率=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%

3　結(jié)果與討論

3.1丹參酮ⅡA殼聚糖納米粒表征結(jié)果 通過透射電子顯微鏡和激光力度粒度儀觀察納米粒的形態(tài)和大小，見圖1。從圖1可以看出，丹參酮ⅡA殼聚糖納米粒為均一實(shí)心球體，大小分布均一，平均水合粒徑為（100±11）nm，多分散指數(shù)為0.09，電位為（12.3±0.56）mV，分散度良好。藥物包封率為（82.1±5.1）%。

圖1　丹參酮ⅡA殼聚糖納米粒透射電境圖片

3.2釋放率測定 分別在不同pH條件下比較丹參酮ⅡA殼聚糖納米粒和丹參酮ⅡA原料體外釋放情況，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，原料藥在不同pH介質(zhì)中釋放較快，在6 h內(nèi)累計(jì)釋放率為85%以上，9 h內(nèi)基本釋放完全。納米粒具有明顯的緩釋作用；其釋放特征具有明顯的兩相特點(diǎn)，即釋放初始階段，藥物釋放比較快，具有明顯的突釋效應(yīng)。隨著藥物不斷由納米粒內(nèi)部逐漸向納米粒表面擴(kuò)散，藥物釋放速率降低，轉(zhuǎn)化為平穩(wěn)緩慢的穩(wěn)態(tài)釋放。納米粒在酸性介質(zhì)中釋放速率明顯高于在中性介質(zhì)中的釋放速率。在pH 5.0介質(zhì)中，藥物在4 h內(nèi)累計(jì)釋放率為33.8%，在24 h內(nèi)基本釋放完全，累計(jì)釋放率達(dá)到94.9%。納米粒在pH 7.4介質(zhì)中體現(xiàn)出更加緩慢的藥物釋放，前4 h，藥物累積釋放率為29.5%，在24 h內(nèi)累積釋放率為83.4%，48 h內(nèi)為95.6%。

圖2　丹參酮ⅡA殼聚糖納米粒和丹參酮ⅡA原料藥在不同介質(zhì)中的體外釋放曲線（n=3）

3.3細(xì)胞活力測定 對(duì)空白納米粒材料和載藥納米粒的細(xì)胞毒性進(jìn)行考察，如圖3A可以直觀地看出空白納米粒在72 h內(nèi)對(duì)細(xì)胞的生長幾乎無影響，沒有顯示出明顯的細(xì)胞毒性，材料的生物相容性良好。由圖3B可以看出，相比于游離藥物，載藥納米粒對(duì)細(xì)胞具有更加顯著的抑制作用，細(xì)胞活力明顯降低。對(duì)比IC50值分別為丹參酮ⅡA殼聚糖納米粒為44μg/mL、丹參酮ⅡA為67.27μg/mL。由于納米粒本身具有被腫瘤細(xì)胞吞噬的作用，所以載藥納米粒的對(duì)細(xì)胞的殺傷力要大于原藥的作用。

圖3　空白（A）與載藥（B）納米粒處理SMMC-7721細(xì)胞72 h的細(xì)胞活力

3.4殼聚糖納米粒細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 利用熒光倒置顯微鏡觀察FITC標(biāo)記丹參酮ⅡA殼聚糖納米粒的細(xì)胞攝取情況，結(jié)果見圖4，如圖所示，在細(xì)胞內(nèi)部顯示出明顯的綠色熒光，說明納米粒被細(xì)胞大量攝取，在3 h內(nèi)，納米粒已經(jīng)明顯聚集在納米粒的內(nèi)部，隨著時(shí)間的增長，細(xì)胞內(nèi)部熒光強(qiáng)度明顯增加，說明納米粒隨著時(shí)間的延長而被大量吞噬，導(dǎo)致藥物在細(xì)胞內(nèi)部濃集。

4　討論

殼聚糖作為天然高分子材料廣泛存在于自然界中。它具有良好的生物相容性，無毒副作用及生物降解性等優(yōu)點(diǎn)。因此利用殼聚糖作為輔料所制備的殼聚糖納米粒同時(shí)具有良好的生物相容性和生物可降解性無毒副作用等特點(diǎn)［13-14］。殼聚糖作為自然界唯一的天然陽離子多糖，其具有大量的帶正電的胺基，多聚磷酸鈉帶有大量負(fù)電荷，通過正負(fù)離子吸引，殼聚糖在多聚磷酸鈉周圍聚集成納米粒，納米粒分散度高，其表面具正電荷，腫瘤細(xì)胞表面具負(fù)電荷，通過電荷作用，殼聚糖納米粒很容易被腫瘤細(xì)胞吸附，增加細(xì)胞對(duì)納米粒的吞噬作用，促進(jìn)藥物在細(xì)胞內(nèi)部濃集，增加藥物的療效。

圖4　包裹FITC的殼聚糖納米粒細(xì)胞攝取熒光圖片

納米粒體外釋放實(shí)驗(yàn)表明，在釋放初期，納米粒會(huì)產(chǎn)生一定程度的藥物突釋。主要原因可能是一部分藥物在納米粒制備及干燥過程中可能吸附在納米粒表面，當(dāng)與釋放介質(zhì)接觸時(shí)，能夠迅速進(jìn)入介質(zhì)中，導(dǎo)致藥物的突釋。隨著時(shí)間的推移，殼聚糖不斷被降解和溶蝕，藥物通過擴(kuò)散從納米粒內(nèi)部逐漸釋放，從而維持藥物的緩慢長期釋放。

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1001-1528（2015）03-0646-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.042

2014-05-04

車環(huán)宇（1987—），女，碩士生，研究方向?yàn)橹形魉幬镄滦徒o藥系統(tǒng)。Tel：15940658921，E-mail：chechehuanyu@163.com

承 偉（1958—），男，博士，教授，研究方向?yàn)橹形魉幬镄滦徒o藥系統(tǒng)。Tel：18104068377，E-mail：cheng2553807@ 126.com