趙 晶， 徐守竹， 宋 凡， 年 倫， 周暄宣， 王四旺

（第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系天然藥物學(xué)教研室，陜西　西安　710032）

二苯乙烯苷調(diào)節(jié)ROS相關(guān)JNK通路對(duì)LPC誘導(dǎo)HUVECs損傷的作用

趙 晶， 徐守竹， 宋 凡， 年 倫， 周暄宣， 王四旺*

（第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系天然藥物學(xué)教研室，陜西西安710032）

目的 探討從何首烏提取的二苯乙烯苷（TSG）對(duì)溶血卵磷脂（LPC）誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）凋亡的影響及其可能機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)HUVECs，篩選溶血卵磷脂損傷內(nèi)皮細(xì)胞的最適藥物濃度，采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力，透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)和觀察活性氧（ROS）水平，Western blot檢測(cè)p-JNK蛋白的水平。結(jié)果 LPC能引起細(xì)胞損傷，并隨質(zhì)量濃度增加，細(xì)胞活力降低，其中10μg/mL LPC作用細(xì)胞后，與正常組比較細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞內(nèi)空泡增多，線粒體腫脹，產(chǎn)生ROS的水平增高，p-JNK蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。經(jīng)二苯乙烯苷預(yù)處理1 h后，二苯乙烯苷1.0μmol/L和10μmol/L組與溶血卵磷脂組比較，細(xì)胞活力增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)空泡減少，線粒體較完整，產(chǎn)生ROS水平降低，p-JNK蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05）。結(jié)論 二苯乙烯苷具有降低溶血卵磷脂所致HUVECs的細(xì)胞損傷作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)ROS相關(guān)JNK通路有關(guān)。

二苯乙烯苷；溶血卵磷脂（LPC）；人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）；ROS；p-JNK

動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）的形成是一個(gè)多因素的復(fù)雜過程，常見的動(dòng)脈粥樣硬化的誘發(fā)因素有高血脂、高血壓、糖尿病以及吸煙等，這些因素均與內(nèi)皮功能障礙有關(guān)［1-4］。血管內(nèi)皮損傷被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)［5］。因此尋找一種有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和降低心血管疾病的藥物非常重要。

二苯乙烯苷（2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucosid，TSG）是從寥科植物何首烏的干燥塊根中提取的水溶性生物活性成分，研究表明TSG有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗動(dòng)脈粥樣硬化［6-9］、抗血小板凝集［10］、促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)［11］和提高記憶力與學(xué)習(xí)能力［12-13］等作用。近些年來在抗動(dòng)脈粥樣硬化方面被人們廣泛關(guān)注，但其作用機(jī)制仍不明確。Ox-LDL是動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素，而溶血卵磷脂（lysophosphatidylcholine，LPC）是ox-LDL的有效成分，研究發(fā)現(xiàn)溶血卵磷脂能夠完全模擬ox-LDL致動(dòng)脈粥樣硬化作用，并有促進(jìn)單核細(xì)胞的化學(xué)趨化作用，促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖，抑制內(nèi)皮源性舒張因子引起的血管舒張［14］。本研究主要觀察TSG對(duì)LPC所致HUVECs損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料及主要儀器

1.1.1藥物與試劑 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所上海細(xì)胞庫）；二苯乙烯苷（批號(hào)120619）、辛伐他汀（批號(hào)100601-201003）均為中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；溶血卵磷脂（批號(hào)111M5210V）購自Sigma公司；DMEM/LOW GLUCOSE和胎牛血清購自Hy-Clone公司；胰蛋白酶購自南京建成科技有限公司；CCK-8試劑盒、ROS試劑盒均購自上海碧云天生物有限公司，抗體p-JNK購自Abcam公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 酶標(biāo)儀M680-UV（Bio-Rad Laboratories，Marnes La Coquette，法國(guó)）；流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson，San Jose，CA，美國(guó)）；透射電鏡（JEM-101，Jeol Electron Inc，日本）；激光共聚焦顯微鏡（Olympus FV1000，日本）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HUVECs接種于無菌培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的低糖培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、95%飽和相對(duì)濕度條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的內(nèi)皮細(xì)胞，用MTT法篩選不同質(zhì)量濃度溶血卵磷脂（5、10、20、40μg/mL）對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響，確定溶血卵磷脂對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的最適藥物質(zhì)量濃度。其余實(shí)驗(yàn)均分為6組：（1）DMEM組；（2）溶血卵磷脂組；（3）Simvastatin組，即5μmol/L辛伐他汀預(yù)處理1 h+終質(zhì)量濃度10μg/mL溶血卵磷脂處理24 h；（4）二苯乙烯苷（0.1）組，即0.1μmol/L二苯乙烯苷預(yù)處理1 h+終質(zhì)量濃度10μg/mL溶血卵磷脂處理24 h；（5）二苯乙烯苷（1.0）組，即1.0μmol/L二苯乙烯苷預(yù)處理1 h+終質(zhì)量濃度10μg/mL處理24 h；（6）二苯乙烯苷（10.0）組，即10.0μmol/L二苯乙烯苷預(yù)處理1 h+終質(zhì)量濃度10μg/mL處理24 h。

1.2.2MTT法篩選LPC造模質(zhì)量濃度 取接種在96孔板中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基同步培養(yǎng)12 h，每組設(shè)8個(gè)平行復(fù)孔。按分組要求給予不同處理因素，培養(yǎng)24 h后，每孔加MTT 20 μL，培養(yǎng)4 h后，棄上清，加入DMSO 150μL，待紫色結(jié)晶完全溶解后，用酶聯(lián)免疫儀在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度值。

1.2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取接種在96孔板中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基同步培養(yǎng)12 h，再換新鮮培養(yǎng)基，按分組要求給予不同的處理因素，每組設(shè)8個(gè)平行復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加CCK-8 20μL，培養(yǎng)4 h后，用酶聯(lián)免疫儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度值。

1.2.4透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC接種在6孔板內(nèi)，3 mL/孔，接種密度約為3×105個(gè)/孔，用含10%胎牛血清的低糖培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、95%飽和相對(duì)濕度條件下培養(yǎng)至鋪滿80%，無血清培養(yǎng)基同步12 h后，按分組要求給予不同的處理因素，在37℃、5%CO2、95%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，收集細(xì)胞，800 r/min離心5min，棄上清，PBS漂洗2遍，離心去PBS，立即加戊二醛固定。再經(jīng)固定，脫水，浸透，包埋，修塊，切片，電子染色過程后，在透射電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.5激光共聚焦法觀察并檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC接種在6孔板內(nèi)，3 mL/孔，接種密度約為3×105個(gè)/孔，用含10%胎牛血清的低糖培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、95%飽和濕度條件下培養(yǎng)至鋪滿80%，無血清培養(yǎng)基同步12 h后，按分組要求給予不同的處理因素，在37℃、5%CO2、95%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，PBS沖洗3遍，加入含有10μmol/L DCFH-DC的培養(yǎng)液，37℃孵育箱中避光培養(yǎng)20 min，用無血清培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞3次，然后用激光共聚焦顯微鏡觀察并檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。

1.2.6Western blotting檢測(cè)p-JNK蛋白的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC接種在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶5 mL，接種密度約為6×105個(gè)/瓶，用含10%胎牛血清的低糖培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、95%飽和相對(duì)濕度條件下培養(yǎng)至鋪滿80%，無血清培養(yǎng)基同步12 h后，按分組要求給予不同的處理因素，在37℃、5%CO2、95%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，收集各組細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。每組取60μg蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST的封閉液中4℃過夜，加入一抗4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜10 min×4，加HRP標(biāo)記二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，室溫下用脫色搖床TBST洗膜10 min×3?；瘜W(xué)發(fā)光試劑顯色，膠片顯影，掃描膠片后用凝膠圖像分析系統(tǒng)測(cè)光面密度值。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用單因素方差分析（ANOVA）及t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，以P＜0.05表示有顯著性差異。

2　結(jié)果

2.1篩選LPC損傷HUVECs的最適藥物質(zhì)量濃度

MTT結(jié)果（圖1）顯示，以不同質(zhì)量濃度溶血卵磷脂（0、5、10、20、40μg/mL）作用于HUVECs 24 h后，隨著LPC質(zhì)量濃度的增加，HUVECs的活力逐漸降低，其中5μg/mL溶血卵磷脂處理后細(xì)胞活力無明顯差異（P＞0.05），10～40 μg/mL溶血卵磷脂處理細(xì)胞后，細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）。故選擇10μg/mL溶血卵磷脂為造模質(zhì)量濃度。

注：與DMEM組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

2.2二苯乙烯苷對(duì)溶血卵磷脂損傷HUVECs活力的影響 CCK-8結(jié)果（圖2）顯示，給藥24 h處理后，損傷組細(xì)胞活力明顯降低，TSG組，隨著濃度增加，細(xì)胞活力逐漸增加，與溶血卵磷脂組比較1μmol/L TSG和10μmol/L TSG保護(hù)作用顯著（P＜0.05）。

圖2　二苯乙烯苷對(duì)溶血卵磷脂損傷內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effects of TSG on HUVECs-induced by LPC

2.3二苯乙烯苷對(duì)溶血卵磷脂損傷HUVECs形態(tài)的影響 透射電鏡下觀察，損傷組較正常組空泡明顯增多，線粒體腫脹，細(xì)胞受損程度顯著，TSG預(yù)處理后，隨著濃度增高，細(xì)胞形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，空泡減少，線粒體豐富，細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于正常。見圖3。

圖3　二苯乙烯苷對(duì)溶血卵磷脂損傷內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響（6000×）Fig.3 Effects of LPC-induced on cellmorphology of TSG（originalmagnification 6000×）

2.4二苯乙烯苷對(duì)LPC誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生水平的影響 采用激光共聚焦顯微鏡法，直接觀察并檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。LPC組細(xì)胞內(nèi)熒光水平明顯增強(qiáng)，二苯乙烯苷組，隨著濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)熒光水平逐漸降低。HUVECs經(jīng)溶血卵磷脂處理24 h，與正常組比較細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加7.72倍（表1），但經(jīng)0.1、1.0、10.0μmol/L二苯乙烯苷預(yù)處理，細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯下降?？梢?，二苯乙烯苷處理可劑量依賴性明顯降低溶血卵磷脂誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS。見表1。

表1　二苯乙烯苷對(duì)溶血卵磷脂損傷內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ROS水平的影響（±s，n=3）Tab.1 Effects of TSG on HUVECs-induced by LPC the production of ROS（±s，n=3）

表1　二苯乙烯苷對(duì)溶血卵磷脂損傷內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ROS水平的影響（±s，n=3）Tab.1 Effects of TSG on HUVECs-induced by LPC the production of ROS（±s，n=3）

注：與DMEM組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與溶血卵磷脂組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別活性氧（平均熒光強(qiáng)度值）DMEM組9.56±5.95溶血卵磷脂組83.41±10.82##Simvastatin組29.01±8.71*二苯乙烯苷0.1 mol/L組65.64±8.25二苯乙烯苷1.0 mol/L組32.30±7.23*二苯乙烯苷10.0 mol/L組20.43±4.22**

2.5二苯乙烯苷對(duì)LPC損傷HUVECs p-JNK表達(dá)水平的影響 圖4 Western blot結(jié)果顯示，溶血卵磷脂作用HUVECs 24 h，p-JNK蛋白表達(dá)上調(diào)，與DMEM組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。二苯乙烯苷處理后p-JNK蛋白表達(dá)呈現(xiàn)濃度負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

3　討論

溶血卵磷脂是ox-LDL主要活性成分，已知LPC可誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS引起氧化應(yīng)激并減少NO釋放，進(jìn)而使內(nèi)皮細(xì)胞功能受損［15］。內(nèi)皮細(xì)胞作為血管的第一保護(hù)層，一旦受到損傷，功能發(fā)生障礙，喪失保護(hù)血管的功能，單核細(xì)胞侵入血管壁下層，分泌更多的炎性分子，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞遷移到內(nèi)層而大量增殖，內(nèi)皮細(xì)胞過度凋亡與平滑肌細(xì)胞過度增殖而形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，所以，阻止血管內(nèi)皮細(xì)胞受損是防治動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵措施［16-17］。細(xì)胞凋亡過程中有很多蛋白因子被激活，除了經(jīng)典的caspase級(jí)聯(lián)外，其中最重要的就是環(huán)境壓力感受器JNK和P38［18-19］。JNK蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中，其他可以接受多種刺激而活化，磷酸化JNK又可激活多種核轉(zhuǎn)錄因子，如c-Jun、ATF2和ELK等，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。有研究認(rèn)為JNK的激活可以增強(qiáng)TNF誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生；更有研究證實(shí)，高糖誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生ROS并激活JNK和caspase-3引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［20］。這看似矛盾的結(jié)論提示細(xì)胞凋亡過程中JNK磷酸化激活和ROS大量產(chǎn)生可能有相互促進(jìn)的正反饋效應(yīng)。

圖4　二苯乙烯苷對(duì)溶血卵磷脂損傷內(nèi)皮細(xì)胞p-JNK蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of TSG on p-JNK expression of HUVECsindued by LPC

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPC處理HUVECs 24 h，細(xì)胞活性明顯降低，細(xì)胞內(nèi)空泡增多，線粒體多腫脹，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，p-JNK蛋白表達(dá)明顯升高。二苯乙烯苷處理后細(xì)胞活性顯著增強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)趨于正常，空泡顯著減少，線粒體多數(shù)完整；細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低，p-JNK蛋白表達(dá)量降低，并且這種降低具有劑量依賴性。由此說明JNK在LPC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起到了非常重要的作用，同時(shí)二苯乙烯苷可能是通過或者部分通過ROS調(diào)節(jié)JNK通路起到保護(hù)作用。當(dāng)然JNK基因表達(dá)的調(diào)控過程非常復(fù)雜，其信號(hào)傳導(dǎo)過程中該藥物還參與了哪些調(diào)控尚待進(jìn)一步探討。

總之，深入研究二苯乙烯苷對(duì)ROS/JNK通路的調(diào)控機(jī)制有助于治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物的開發(fā)與創(chuàng)制。

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2，3，5，4′-Tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside regulates ROS-related JNK pathway against LPC-induced HUVECs injury

ZHAO Jing， XU Shou-zhu， SONG Fan， NIAN Lun， ZHOU Xuan-xuan， WANG Si-wang*
（Department of Natural Medicine，School of Pharmacy，F(xiàn)ourth Military Medical Uniυersity，Xi'an 710032，China）

AIM To study the protective effect of 2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside（TSG）extracted from Polygonimultiflori Radix on lysophosphatidylcholine（LPC）-induced HUVECs and to explore its possiblemechanism.METHODS After treating HUVECs with LPC（5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，40 μg/mL）for 24 h，the optimal concentration of LPC was chosen based on the results from MTT assay and the cell viability wasmeasured by CCK-8 assay.Transmission electron microscope was used to study cellmorphology.The level of reactive oxygen species（ROS）production in HUVECs was observed by laser scanning confocal microscope.The expression of p-JNK was detected by Western-blot.RESULTS LPC could induce endothelial cell in-jury.The cell viability decreased with the increase of the concentration of LPC.Compared with DMEM group，the concentration of10μg/mL LPC significantly decreased the cell viability，increased the cell vacuoles，caused mitochondria to swell，increased the production of ROS and significantly up-regulated the expression of p-JNK.Compared with LPC group，TSG treatment group（1.0μmol/L and 10.0μmol/L）enhanced the cell viability，decreased cell vacuoles，mitochondria with complete cristae，and down-regulated the expression of p-JNK（P＜0.05）.CONCLUSION TSG inhibits LPC-induced damage to HUVECs，which may be associated with regulating ROS-related JNK pathway.

2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside（TSG）；lysophosphatidylcholine（LPC）；human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）；endothelial injury；reactive oxygen species（ROS）；p-JNK pathway

R966

A

1001-1528（2015）03-0487-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.005

2014-04-23

陜西省科技統(tǒng)籌重大專項(xiàng)（2012KTCQ03-02）

趙 晶（1987—），女，碩士生，研究方向?yàn)榉肿又兴幣c藥理。E-mail：18792402773@163.com

王四旺（1958—），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榉肿又兴幣c藥理。E-mail：wangsiw@fmmu.edu.cn