吳 琳， 魏 芳， 呂 昕， 董緒燕， 陳 洪

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，油料脂質(zhì)化學(xué)與營養(yǎng)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430062)

1 前言

長鏈多不飽和脂肪酸(Long-chain Polyunsaturated Fatty Acids，LC-PUFAs)是指分子結(jié)構(gòu)中含有兩個或兩個以上不飽和雙鍵，且碳鏈長度為18～22個C的脂肪酸，主要有亞油酸(Leinoleic Acid，LA)、亞麻酸(Linolenic Acid，LnA)、二十碳四烯酸(Arachidonic Acid，ARA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid，EPA)及二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid，DHA)。其中，ARA、EPA及DHA在預(yù)防心血管疾病、降血脂、降低膽固醇、減肥等方面具有明顯的作用，是大腦、眼睛和整個神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮正常功能必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，對人體健康非常重要[1,2]。脂肪酸根據(jù)第一個雙鍵距離甲基端位置的不同，可分為ω-3、ω-6、ω-7、ω-9等系列，攝入適量的ω-3系脂肪酸(如EPA、DHA)可預(yù)防心血管疾病，維護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)健康，起到抗炎等作用；攝入ω-6系脂肪酸(如ARA)可以抑制腫瘤[3]。但攝入過多含DHA的油脂，可能會通過增強(qiáng)膜脂質(zhì)過氧化的易感性，擾亂組織抗氧化系統(tǒng)，進(jìn)而給機(jī)體帶來不利的影響[4]。中國營養(yǎng)學(xué)會于2000年按年齡段對膳食中ω-6/ω-3系脂肪酸的均衡比例給出了適合中國人的平衡建議：2歲以下和60歲以上是4∶1，其它年齡是4～6∶1[5]。因此，對長鏈多不飽和脂肪酸進(jìn)行種類及雙鍵位置的鑒定對脂質(zhì)在營養(yǎng)學(xué)中的研究具有重要意義。

甘油三酯(Triacylglycerols，TAGs)是脂肪酸最主要的存在形式，占食用油組成的95%以上。TAGs是由一個甘油分子與三個脂肪酸分子縮合而成，而脂肪酸在甘油三酯中甘油骨架上的位置分布有兩類：sn-1/3(α)和sn-2(β)，脂肪酸在TAGs中的分布位置決定著油脂的功能特性及吸收代謝情況[6]。例如，Christensen等[7]研究發(fā)現(xiàn)，EPA及DHA處于sn-2位比處于sn-3位的吸收利用要有效得多。已有關(guān)于LC-PUFAs在甘油三酯中位置分布的文獻(xiàn)報道，例如，海豹油TAGs中，PUFAs主要分布在TAGs的α位，而魚油中多分布在β位[8 - 10]。因此，對LC-PUFAs TAGs中脂肪酸酰基位置進(jìn)行剖析對于揭示LC-PUFAs 的營養(yǎng)學(xué)特性有著重要的意義。

隨著色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的迅速發(fā)展，使得脂質(zhì)組成及其結(jié)構(gòu)的高效、高準(zhǔn)確度和高靈敏度的分析與鑒定成為可能。但是在剖析LC-PUFAs TAGs時，除了缺少必要的標(biāo)準(zhǔn)品外，還存在其他困難。因此，需要更高效的色譜分離技術(shù)和新的質(zhì)譜鑒定技術(shù)的支持[11]。本文對LC-PUFAs及LC-PUFAs TAGs的色譜分離及質(zhì)譜鑒定方法進(jìn)行了綜述，包括直接進(jìn)樣質(zhì)譜及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。

2 長鏈多不飽和脂肪酸甘油酯的色譜分析技術(shù)

色譜技術(shù)可以快速、高效地實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)的分離。常用于分離脂質(zhì)的色譜技術(shù)有薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法和超臨界流體色譜法等。而用于LC-PUFAs TAGs分離的方法主要有薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法。

2.1 薄層色譜

薄層色譜(Thin Layer Chromatography，TLC)具有操作簡單，耗資少，省時的優(yōu)勢，常用于脂質(zhì)種類的分離。廣泛用于油脂分離的TLC固定相有硅膠、氧化鋁、硅藻土。近年來，一些新型材料作為TLC的固定相用于分離飽和度不同的脂肪酸甲酯。Amlund等[12]在對魚油脂肪酸和甲基汞相互作用的營養(yǎng)進(jìn)行評估時，采用高效薄層色譜(HPTLC)分離魚油樣品，使用粒徑更小的硅膠作為固定相，得到含長鏈多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)。2012年，Dillon等[13]首次提出巰醇銀(AgTCM)作為TLC的固定相材料，AgTCM-TLC與傳統(tǒng)Ag-TLC都是根據(jù)固定相中的Ag+與雙鍵的π電子之間的相互作用來分離飽和度不同的化合物，但AgTCM對光穩(wěn)定性更強(qiáng)，薄層板壽命更長，AgTCM-TLC已成功應(yīng)用于分離多種長鏈多不飽和脂肪酸甲酯混合物[14]。TLC法分析樣品中TAG時，首先使用合適的展開劑將樣品按照脂質(zhì)種類進(jìn)行分離；然后將TAG組分回收，再在含Ag+的硅膠板上根據(jù)TAG中羧酸基的飽和程度來進(jìn)一步分離。隨著TLC法與可見分光光度計(jì)的結(jié)合，使得TLC可以對TAG進(jìn)行定量分析。鮑方宇等[15]采用磷鉬酸作為顯色劑，通過TLC與可見分光光度計(jì)相結(jié)合的技術(shù)，準(zhǔn)確測定了混合脂肪酸組成的TAG含量，但由于該方法分離回收的效果受硅膠板的質(zhì)量、展開劑、顯色效果等因素的影響較大，因此一般只作為定性分析的一種輔助手段。

2.2 氣相色譜

2.2.1長鏈多不飽和脂肪酸的氣相色譜分析方法氣相色譜(Gas Chromatography，GC)分析TAG時，在進(jìn)樣前，通常需要對TAG進(jìn)行甲酯化衍生，因而甘油三酯是否完全甲酯化是準(zhǔn)確分析油脂中脂肪酸的關(guān)鍵，而甲酯化衍生會導(dǎo)致TAG脂肪酸?；恢梅肿咏Y(jié)構(gòu)信息的丟失，因此GC法主要用于TAGs脂肪酸組成的分析[16]。目前，GC已用于魚油[17,18]、藻油[19]和微生物油脂中含LC-PUFAs TAGs的脂肪酸組成分析。2012年，Delmonte等[20]應(yīng)用新型陰離子氣相色譜毛細(xì)管柱SLB-IL111實(shí)現(xiàn)對脂肪酸異構(gòu)體的分離，通過優(yōu)化色譜條件，同時分離包括長鏈在內(nèi)的多不飽和脂肪酸順反異構(gòu)體和雙鍵位置異構(gòu)體。Liu等[21]應(yīng)用GC-MS對小鼠視網(wǎng)膜中長鏈多不飽和脂肪酸分析時，確定了ω-3/ω-6系脂肪酸的含量比。通過選擇不同的質(zhì)譜掃描模式，比較了碳鏈長度、雙鍵數(shù)及雙鍵位置對GC-MS分析脂肪酸的質(zhì)譜響應(yīng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)全掃描模式下，隨著脂肪酸不飽和度增高，質(zhì)譜響應(yīng)(峰面積)略微降低；而在選擇離子掃描模式時，響應(yīng)隨不飽和度增加而增加，脂肪酸雙鍵位置對響應(yīng)的影響不明顯。

2.2.2長鏈多不飽和脂肪酸甘油酯的GC分析方法隨著高溫氣相色譜(HTGC)固定相的出現(xiàn)，氣相色譜分析高沸點(diǎn)化合物成為可能。在柱溫大于400 ℃的情況下，HTGC與MS聯(lián)用，不需要將TAG進(jìn)行甲酯化衍生，TAG按C數(shù)由小到大依次洗脫。但高溫對不飽和度相對較高的TAGs有破壞作用，因此不適合分析LC-PUFAs TAGs。Sutton等[22]使用HTGC聯(lián)用飛行時間質(zhì)譜(TOF-MS)分離TAGs時，溫度達(dá)到430 ℃，具有相同碳鏈長度的甘油酯及相同雙鍵數(shù)(DBs)的甘油酯出現(xiàn)共洗脫現(xiàn)象，說明HTGC-MS無法實(shí)現(xiàn)對TAGs位置異構(gòu)體的鑒定[23]。

2.3 高效液相色譜

2.3.1非水反相液相色譜由于甘油三酯不溶于水，因此液相色譜常采用非水流動相。基于十八烷基鍵合硅膠固定相(商品化的C18色譜柱)的非水反相液相色譜(Non-aqueous Reversed Phase HPLC，NARP-HPLC)是分析TAG最常用的技術(shù)之一。甘油三酯在C18色譜柱中的保留取決于當(dāng)量碳數(shù)(Equivalent Carbon Number，ECN)，ECN等于甘油三酯中?；溈侰數(shù)(CNs)減去兩倍的雙鍵數(shù)(DBs)，即 ECN=CN-2DB。Momchilova等[24]使用End-capped Superspher RP-18(e)柱，流動相為乙腈和乙醇，梯度洗脫，將PPL/PLP，PPLn/PLnP，PPE/PEP，PPA/PAP，PPD/PDP(其中P：C16∶0，L：C18∶2，Ln：C18∶3，E：C20∶5，A：C20∶4，D：C22∶6)完全分離。通過比較4種ODS色譜柱和6種流動相對TAG保留的影響表明，脂肪酸碳鏈長度、雙鍵數(shù)及不飽和脂肪酸的?；恢檬怯绊懕Ａ魰r間的主要原因。Lisa等[25]分別使用C18色譜柱及C30色譜柱分離黑醋栗油中TAGs，比較了不同流動相條件、洗脫梯度、柱溫對分離結(jié)果的影響。結(jié)果表明相同條件下，C18色譜柱及C30色譜柱分析黑醋栗油中TAG時，出峰時間區(qū)別不大，但是C30色譜柱的分離效果遠(yuǎn)沒有C18色譜柱的分離效果好，只能分離得到38種TAGs，而C18色譜柱可以分離得到83種TAGs；C30色譜柱與C18色譜柱相比，不能分離含α-亞麻酸和γ-亞麻酸的LC-PUFAs TAG雙鍵位置異構(gòu)體；柱溫不會改變C18色譜柱分離TAG的出峰順序，但可以改變C30色譜柱分離TAG的出峰順序；不同初始流動相條件、不同洗脫梯度只會造成保留時間偏移，但不會影響TAG的出峰順序。

2.3.2Ag+液相色譜Ag+液相色譜(Ag-HPLC)是一種特殊的正相色譜，常作為NARP-HPLC分離的互補(bǔ)方法。Ag-HPLC常用于分離TAGs異構(gòu)體，其分離原理是根據(jù)固定相中的Ag+與TAG中雙鍵的π電子之間的電荷轉(zhuǎn)移作用分離TAGs，因此TAGs中雙鍵數(shù)目及位置決定著保留時間。Holapeka等[26]通過串聯(lián)三根Ag+液相色譜柱(ChromSpher Lipids,Varian,USA)分離TAGs雙鍵位置異構(gòu)體及脂肪酸?；恢卯悩?gòu)體，分別聯(lián)用5種不同類型的質(zhì)譜檢測器，并對分析結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，檢測器的類型對得到的碎片離子豐度比的影響低于脂肪酸的雙鍵數(shù)目、雙鍵位置及?；溤诟视凸羌苤械姆植嘉恢脤Φ玫降乃槠x子豐度比的影響。同時也表明串聯(lián)三根Ag+液相色譜柱仍無法分離sn-2位TAG雙鍵位置異構(gòu)體(如Lα-LnL與Lγ-LnL)[27,28]。

Ag-HPLC分離TAG時的分離效率受三個因素影響：流動相組成、柱溫及色譜柱性能[29]。合適的流動相能顯著提高Ag-HPLC分離TAG異構(gòu)體的分離效率，而柱溫對TAG異構(gòu)體在Ag+色譜柱中保留時間的影響相當(dāng)復(fù)雜。目前Ag-HPLC使用的色譜柱主要為商品化Spher Lipids色譜柱[30]。但常規(guī)Ag+色譜柱對多不飽和TAGs的分析都表現(xiàn)出低重現(xiàn)性，且無法實(shí)現(xiàn)雙鍵數(shù)大于7的TAG異構(gòu)體的分離，對于雙鍵數(shù)更多的TAGs，出峰時間很長甚至不出峰。

Leskinen等[31]通過將Ag+鍵合于EC 250/4.6 Nucleosil 100-5 SA色譜柱，成功分離黑加侖籽油中Ala/L/L與Gla/L/L(Ala為α-亞麻酸，Gla為γ-亞麻酸，L為亞油酸)雙鍵位置異構(gòu)體。Dillon等[32,33]將Ag+鍵合到3-巰基丙基固定相上制備硫醇銀(AgTCM)液相色譜柱，其分離原理與Ag+的分離原理相似，都能按照雙鍵數(shù)不同將分析物分離。由于硫醇和Ag+形成了較強(qiáng)的配位化合物，使得AgTCM色譜柱的穩(wěn)定性及分析物保留時間的重現(xiàn)性較常規(guī)Ag+色譜柱更佳，但目前只應(yīng)用于長鏈多不飽和脂肪酸乙酯的分離。

Ag-HPLC雖然可以分離TAG?；恢卯悩?gòu)體及雙鍵位置異構(gòu)體，但分離含EPA和DHA等LC-PUFAs TAGs位置異構(gòu)體仍然是一個難題[34]，通常需要串聯(lián)兩根或兩根以上的Ag+色譜柱，但也只能實(shí)現(xiàn)部分TAG異構(gòu)體分離，不僅耗時，而且增加了分析成本。

表1列出了文獻(xiàn)中已報道的不同液相色譜柱分離鑒定長鏈多不飽和脂肪酸甘油酯的研究及其應(yīng)用。

表1 不同液相色譜柱分離長鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的應(yīng)用

3 LC-PUFAs TAGs的直接進(jìn)樣質(zhì)譜鑒定技術(shù)

直接進(jìn)樣MS應(yīng)用最廣泛的電離源是電噴霧電離(Electronic Spray Ion，ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離(Matrix-assisted Laser Desorption Ionization，MALDI)。MS成像技術(shù)可以提供形象化的脂肪酸分布信息，Shah等[50]應(yīng)用此方法已形象化的鑒定了人血漿中不飽和度為3的TAG分子。由于其可視化的優(yōu)點(diǎn)，常被用于生物樣品分析，主要用于多種生物樣品中LC-PUFAs磷脂分子分析。

3.1 電噴霧電離質(zhì)譜

近年來，也有很多新型技術(shù)應(yīng)用于ESI-MS中，用于鑒定LC-PUFAs TAGs。2012年，Pham等[55]首次將原子團(tuán)定向解離方法應(yīng)用于油脂分析，通過向TAG異構(gòu)體中添加4-碘苯胺(IA)形成[TAG+IA]+，在一定的CID作用下，[TAG+IA]+發(fā)生α斷裂與β-裂解，因而產(chǎn)生不同的碎片離子，根據(jù)這些碎片離子可鑒定TAG中脂肪酸位置和雙鍵位置，應(yīng)用該方法已成功鑒定了含亞麻酸的TAG?；恢卯悩?gòu)體及雙鍵位置異構(gòu)體。

3.2 基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜

近年來，MALDI-MS已越來越多用于脂質(zhì)分析。同ESI-MS一樣，這項(xiàng)技術(shù)已應(yīng)用于分析磷脂[56]、TAGs[57]以及脂肪酸[58]。MALDI與ESI-MS不同的是對所有的脂質(zhì)都能產(chǎn)生正離子，使得在一個圖譜中能觀察到寬范圍的脂類。MALDI的優(yōu)勢在于其對基質(zhì)的耐受性，如緩沖鹽等，且適合大量樣品的生物學(xué)分析。可以通過添加相應(yīng)的鹽產(chǎn)生[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+等離子。Kubo等[59]采用單一同位素前體離子模式分析橄欖油中的TAG，通過高能量的碰撞誘導(dǎo)解離(CID)使加鈉TAG產(chǎn)生遠(yuǎn)電荷碎裂，提高了前體離子選擇性，實(shí)現(xiàn)TAG更完整的分析。Danielewicz等[60]利用MALDI技術(shù)分析了微藻油中TAGs的組成，鑒定出C數(shù)為18和20，雙鍵數(shù)最高為4的多不飽和脂肪酸，同時也指出由于MALDI常與飛行時間質(zhì)量分析器(TOF)聯(lián)用，其靈敏度很高，對每個TAGs相似物都有響應(yīng)，不適合用于定量含長鏈多不飽和脂肪酸的TAGs。MALDI-MS需要合適的基質(zhì)才能獲得好的重現(xiàn)性及靈敏度，其定性定量能力不如ESI-MS和大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜(APCI-MS)。

4 LC-PUFA TAG不同分析方法的比較

常用于分離LC-PUFA TAG的色譜方法有：TLC、HTGC、HPLC及2D-LC。TLC具有操作簡單、成本低廉、對設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn)，但利用該方法分離甘油三酯時，分離回收的效果受硅膠板、擴(kuò)展劑及操作水平等因素的影響較大，且定量困難。HTGC可以直接分析TAG，TAG在耐高溫的氣相色譜柱上按C數(shù)由小到大依次洗脫，但長鏈多不飽和脂肪酸在高溫下容易發(fā)生熱降解，因此HTGC更適合用于分析相對飽和的TAG。NARP-HPLC法可以實(shí)現(xiàn)對具有不同ECN值TAGs的有效分離，但是難以分離具有相同ECN值的TAG，對TAG位置異構(gòu)體的分離選擇性也較差。Ag+色譜可以根據(jù)甘油三酯的雙鍵數(shù)目、雙鍵位置等因素將ECN值相同的甘油三酯進(jìn)行分離，是非水反相液相色譜法的有效補(bǔ)充，TAG雙鍵數(shù)越多，在Ag+色譜柱上的保留時間越長，串聯(lián)三根Ag+色譜柱仍無法實(shí)現(xiàn)雙鍵數(shù)大于7的LC-PUFA TAG位置異構(gòu)體的分離[61]。將NARP-HPLC和Ag-HPLC兩種不同保留機(jī)理的分離模式離線或在線聯(lián)用，構(gòu)建2D-HPLC分離系統(tǒng)，是實(shí)現(xiàn)TAG高選擇性分離的有效途徑。此外，最近有研究采用無封端聚合ODS柱(Non-endcapped Polymeric ODS，ODS-P)實(shí)現(xiàn)了對LC-PUFA TAG位置異構(gòu)體的分離。

5 LC-PUFAs TAGs的定量手段

5.1 LC-PUFAs TAGs的定量方法

胡珺等[36]研究發(fā)現(xiàn)，雙鍵數(shù)大于3和小于3的TAG在質(zhì)譜上的響應(yīng)有著很大的差別，進(jìn)而將食用油中的甘油三酯根據(jù)不飽和度不同分為兩組(不飽和度大于等于3和小于3)，通過選取各組中具有代表性的7種甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后選取與目標(biāo)TAGs結(jié)構(gòu)最為相似的標(biāo)準(zhǔn)品所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線對TAGs進(jìn)行定量分析。該類比標(biāo)準(zhǔn)曲線定量方法有效地克服了不同結(jié)構(gòu)甘油三酯質(zhì)譜峰響應(yīng)差別比較大的問題，解決了需要對所有甘油三酯都建立標(biāo)準(zhǔn)曲線以達(dá)到其量化的問題。此外，還有少數(shù)文獻(xiàn)報道了使用響應(yīng)因子對甘油三酯進(jìn)行定量分析的方法。Li等[62]在定量擬南芥中TAG時，采用ESI-MS多重中性丟失掃描模式，以相同C數(shù)，不同雙鍵數(shù)的TAGs以及不同C數(shù)，相同雙鍵數(shù)的TAGs在質(zhì)譜上的相對響應(yīng)因子(設(shè)十七碳烯酸三甘油酯的響應(yīng)因子為1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，共定量了擬南芥種子中93個TAGs分子。

5.2 LC-PUFAs TAGs異構(gòu)體的定量方法

目前主要有三種方法用于定量分析TAG異構(gòu)體。最早用于定量分析TAGs異構(gòu)體的方法是利用酶的選擇性水解作用。雖然酶對立體定向位置和特定碳鏈長度脂肪酸的選擇性是已知的，但是準(zhǔn)確地應(yīng)用酶的立體選擇性依賴于實(shí)驗(yàn)條件，通常不能實(shí)現(xiàn)直接定量。第二種方法是色譜分離TAGs異構(gòu)體，聯(lián)用質(zhì)譜檢測器進(jìn)行鑒定，但是LC-PUFAs TAG異構(gòu)體的色譜分離仍是一大難題。第三種方法，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，不需要實(shí)現(xiàn)對異構(gòu)體的分離，通過建立不同濃度比的異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品與碎片離子豐度比的標(biāo)準(zhǔn)曲線來進(jìn)行定量。Herrera等[39]利用LC-ESI-MS3建立多種含EPA和DHA的長鏈多不飽和脂肪酸甘油酯不同含量比與碎片離子豐度比的標(biāo)準(zhǔn)曲線，成功確定EPA，DHA在魚油TAG中酰基化位置，實(shí)現(xiàn)對實(shí)際油脂樣品中特定異構(gòu)體的定量分析。Ramaley等[63]分別將每對LC-PUFAs TAGs?；恢卯悩?gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品混合進(jìn)樣，建立異構(gòu)體濃度百分比與碎片離子豐度比的曲線關(guān)系，即檢測到的碎片離子豐度比對應(yīng)為異構(gòu)體對中一個異構(gòu)體的濃度百分比，用該方法實(shí)現(xiàn)了實(shí)際樣品中異構(gòu)體各組分的定量，同時也發(fā)現(xiàn)所建立的含有EPA 、DHA 的四對甘油三酯?；恢卯悩?gòu)體的曲線為非線性關(guān)系。

6 結(jié)論與展望

色譜與質(zhì)譜技術(shù)的迅速發(fā)展，已能實(shí)現(xiàn)對許多甘油酯的組成及結(jié)構(gòu)的高效、高準(zhǔn)確度和高靈敏度的分離鑒定。但對具有較高營養(yǎng)價值，易氧化的長鏈多不飽和脂肪酸甘油酯的分析仍存在諸多挑戰(zhàn)。首先，缺少高純度的LC-PUFAs TAGs異構(gòu)體標(biāo)品，而合成這樣的異構(gòu)體需要花費(fèi)高額的費(fèi)用，成為限制其鑒定的主要原因；其次，LC-PUFAs TAGs不飽和度較高，碳鏈較長，質(zhì)譜裂解機(jī)制復(fù)雜，分離鑒定難，進(jìn)而增加了定量難度。因此對LC-PUFAs TAGs的研究方向包括：建立LC-PUFAs TAGs異構(gòu)體的合成方法，大力開發(fā)和優(yōu)化各種色譜分析手段與質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用，完善快速、高通量、高靈敏度的剖析LC-PUFAs TAGs的方法，并進(jìn)一步完善定量分析方法。