葉　帆，李明星，羅志建，陳曉梅，宣吉晴

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 瀘州　646000）

超聲造影監(jiān)測缺血再灌注損傷兔腎皮質(zhì)血流動力學(xué)改變的實(shí)驗研究

葉帆，李明星，羅志建，陳曉梅，宣吉晴

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 瀘州646000）

目的：采用超聲造影（CEUS）定量分析技術(shù)動態(tài)監(jiān)測腎缺血再灌注損傷（Renal ischemia reperfusion injury，RIRI）后兔腎皮質(zhì)血流灌注的改變。方法：54只家兔隨機(jī)分為正常對照組，腎缺血后再灌注第2 h組、第16 h組、第24 h組、第3 d組、第5 d組。行CEUS并應(yīng)用時間-強(qiáng)度曲線測量灌注峰值時間（TTP）、曲線上升支斜率（β）、灌注峰值強(qiáng)度（A）、曲線下面積（AUC），觀察各參數(shù)的變化并分析與病理改變的相關(guān)性。結(jié)果：腎缺血恢復(fù)灌注后各組與對照組相比TTP值增加，β值降低，AUC增大（P＜0.05）；缺血再灌注組各組間TTP、β有統(tǒng)計學(xué)差異，其中恢復(fù)灌注后第3d的TTP的延長和β的下降最為顯著（P＜0.01）。A值在RIRI后第16 h，24 h，3 d較對照組降低（P＜0.05），第3d最為顯著（P＜0.01）。結(jié)論：CEUS定量分析技術(shù)能在缺血再灌注損傷發(fā)生后早期發(fā)現(xiàn)腎皮質(zhì)血流灌注的異常，腎缺血再灌注損傷早期即發(fā)生腎皮質(zhì)微循環(huán)障礙，在第3 d腎皮質(zhì)微循環(huán)灌注受損最為嚴(yán)重，度過這一“危險期”，腎皮質(zhì)微循環(huán)受損得以改善，CEUS定量分析技術(shù)能敏感反映這一過程。

腎；再灌注損傷；兔；超聲檢查，多普勒，彩色；尿路造影術(shù)

腎臟作為機(jī)體主要的高血流灌注的器官之一，因缺乏側(cè)支循環(huán)易發(fā)生腎缺血再灌注損傷（Renal ischemia reperfusion injury，RIRI）。RIRI是導(dǎo)致腎移植術(shù)后急性腎功能衰竭及影響移植腎早期功能恢復(fù)的關(guān)鍵因素之一。由于RIRI大多為可逆性損傷，及時診斷和治療有助于腎功能的恢復(fù)。但由于RIRI沒有特異的臨床表現(xiàn)，且缺少合適的篩查方法，容易導(dǎo)致漏診。腎血流動力學(xué)與腎功能損傷相互影響、相互作用，因此本研究通過制備家兔RIRI模型，應(yīng)用超聲造影（Contrast-enhanced ultrasonography，CEUS）定量分析RIRI后兔腎皮質(zhì)微循環(huán)血流動力學(xué)的變化規(guī)律，探討CEUS在臨床早期診斷及預(yù)后判斷中的價值。

1　材料與方法

1.1兔腎缺血再灌注模型的建立

1.1.1動物分組

健康成年新西蘭大白兔54只，體質(zhì)量2.1～2.5 kg（瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心提供。動物許可證：SCXK川 201017）。54只家兔隨機(jī)分為正常對照組（R0），缺血后再灌注第2 h組（R1）、第16 h組（R2）、第24 h組（R3），第3 d組（R4），第5 d組（R5），每組各9只。

1.1.2動物模型制作

目前RIRI動物模型的建立方法包括切除一側(cè)腎臟，夾閉另一側(cè)腎蒂或者夾閉雙側(cè)腎蒂，缺血時間不超過60 min。而切除一側(cè)腎臟，夾閉另一側(cè)腎動脈建立RIRI模型與雙腎模型相比更接近腎移植狀態(tài)［1］。因此本實(shí)驗采取切除右腎，夾閉左腎動脈60 min后恢復(fù)灌流建立兔RIRI模型，與正常家兔比較RIRI前后腎皮質(zhì)血流動力學(xué)改變。

R0組家兔行左腎CEUS，R1～R5組家兔給予速眠新Ⅱ（吉林省有限公司華牧動物保健品有限公司；規(guī)格：2 mL∶40 mg）0.2 mL/kg肌肉注射麻醉家兔。俯臥位固定，雙腎區(qū)脫毛，消毒皮膚后行右側(cè)腰背部正中旁切口，鈍性分離腎周脂肪囊，暴露右腎，結(jié)扎右腎蒂，切除右腎，同樣方法游離左腎后分離出左腎動脈，使用無創(chuàng)動脈夾夾閉腎動脈造成缺血，觀察到左腎顏色由鮮紅變暗紅，表明缺血成功，60 min后松開動脈夾，觀察左腎顏色由暗紅變鮮紅，表示再灌注成功，于松開動脈夾時開始計算再灌注時間。術(shù)后，室溫下清潔飼養(yǎng)。R1、R2、R3、R4、R5組家兔分別于再灌注后第2 h、第16 h、第24 h、第3 d、第5 d行CEUS檢查。各組家兔在完成CEUS檢查后即刻處死并切除左腎，取部分左腎皮質(zhì)經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%的甲醛固定，待測。組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟和包埋，常規(guī)切片（3 μm）作蘇木精-伊紅染色制片，光學(xué)顯微鏡放大倍數(shù)為40倍，交由病理專業(yè)人士進(jìn)行檢查，采用單盲法觀察腎皮質(zhì)病理變化情況。

1.2CEUS檢查

采用GE LOGIQ 9彩超診斷儀，探頭頻率7.5MHz，諧波造影模式。進(jìn)入造影模式后，保持儀器設(shè)置恒定（機(jī)械指數(shù)0.08，深度4 cm，增益52%，幀頻50 Hz，動態(tài)范圍50 dB，時間增益補(bǔ)償，聚焦范圍等滑塊全部置于中間位置）。造影劑 SonoVue（BRACCO Imaging B.V公司生產(chǎn)，瑞士；規(guī)格：SF6氣體59 mg∶凍干粉25 mg）按說明將凍干粉中注入生理鹽水5 mL配置成混懸液，按0.1 mL/kg劑量抽取震蕩混勻后的造影劑經(jīng)耳緣靜脈團(tuán)注，隨后注入1 mL生理鹽水沖洗管道。注射造影劑的同時啟動超聲儀內(nèi)置計時器，取腎冠狀位最大截面觀察并保存動態(tài)影像6 min。應(yīng)用彩超儀內(nèi)置時間-強(qiáng)度曲線（Time-intensity curve，TIC）分析軟件（Wash in/Wash out）分析血流灌注參數(shù)。有研究表明對于不同大小及形狀的感興趣區(qū)（Region of interest，ROI），腎血流灌注各項定量參數(shù)之間存在著一定的差異［2］。此外腎皮質(zhì)、髓質(zhì)和皮質(zhì)髓質(zhì)交界處血流量也存在差異［3］。因此本實(shí)驗中統(tǒng)一設(shè)置ROI為直徑3 mm，面積為7.07 mm2的圓形，放置于腎最大冠狀截面中央的腎實(shí)質(zhì)中部以保證所得的各灌注參數(shù)具有可比性。

觀察和分析如下指標(biāo)：①視覺狀態(tài)下造影增強(qiáng)及消退模式；②TIC曲線參數(shù)：灌注峰值時間（Time to pick，TTP）；曲線上升支斜率（β）；灌注峰值強(qiáng)度（Amplitude of peak intence，A）；曲線下面積（Area under curve，AUC）。所有參數(shù)連續(xù)測量3次以減少誤差。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件處理所得數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兔腎灰階CEUS表現(xiàn)

R1～R5組45只家兔成功制作成RIRI模型?；译ACEUS模式下，R0在經(jīng)耳緣靜脈團(tuán)注造影劑后，沿腎各級動脈依次增強(qiáng)，至整個左腎腎皮質(zhì)、腎髓質(zhì)形成“火球樣”增強(qiáng)。R1～R5組造影增強(qiáng)模式同前，但腎皮質(zhì)增強(qiáng)達(dá)高峰時間延遲，消退時間延長。

2.2各組TIC參數(shù)比較

各組經(jīng)Wash in/Wash out軟件自動描記生成的TIC曲線見圖1～6。

圖1　正常對照組（R0組）兔腎皮質(zhì)TIC曲線?！D2　RIRI后第2 h（R1組）兔腎皮質(zhì)TIC曲線。Figure 1.The TIC of the control group（R0）.　Figure 2.The TIC of reperfusion group for 2 h（R1）.

在發(fā)生RIRI前后的不同階段，各灌注參數(shù)的改變見表1，與對照組相比，RIRI發(fā)生后的不同階段均表現(xiàn)為TTP延長，β降低（P＜0.05），RIRI各組間TTP及β的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。其中RIRI發(fā)生后2 h后即可觀察到TTP延長，β降低，隨RIRI進(jìn)展TTP延長及β降低的程度加重，第3 d最為顯著（P＜0.01），而恢復(fù)灌注后第5 d的TTP和β則有所改善。A值在RIRI后第16 h，24 h，3 d較對照組降低（P＜0.05），第3 d最為顯著（P＜0.01）。AUC在RIRI后各組與對照組相比均增加（P＜0.05），但RIRI各組組間AUC并無顯著差異（P＞0.05）。

圖3　RIRI后第16 h（R2組）兔腎皮質(zhì)TIC曲線?！D4　RIRI后第24 h（R3組）兔腎皮質(zhì)TIC曲線。Figure 3.　The TIC of reperfusion group for 16 h（R2）.Figure 4.　The TIC of reperfusion group for 24 h（R3）.

圖5　RIRI后第3 d（R4組）兔腎皮質(zhì)TIC曲線?！D6　RIRI后第5 d（R5組）兔腎皮質(zhì)TIC曲線。Figure 5.The TIC of reperfusion group for 3 d（R4）.Figure 6.The TIC of reperfusion group for 5 d（R5）.

Table 1　Analysis of TIC parameters in different groups

發(fā)生RIRI 2 h后，腎小球結(jié)構(gòu)無明顯變化，腎小管上皮細(xì)胞輕微變性，腎間質(zhì)水腫不明顯，僅少許炎細(xì)胞浸潤，隨時間延長，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、壞死和脫落，管腔擴(kuò)張，腎間質(zhì)水腫、炎性細(xì)胞浸潤的程度隨之加重，腎小管管腔內(nèi)見大量管型，直小靜脈內(nèi)可見大量紅細(xì)胞聚集，間質(zhì)可見炎細(xì)胞浸潤。R5組腎小管上皮細(xì)胞變性及壞死及間質(zhì)充血、水腫有所改善，新生毛細(xì)血管數(shù)量增多，部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)再生現(xiàn)象。

3　討論

RIRI后存在腎內(nèi)血流動力學(xué)和血流分布的異常，整體腎血流量可降低約50%。超聲可通過彩色多普勒測量腎各級動脈的血流參數(shù)等指標(biāo)來推斷腎血流灌注的改變。雖然彩色多普勒半定量評價腎臟血流灌注有肯定的價值，但受操作者手法、儀器分辨率及不能對腎弓形動脈及其以下微小血管的血流灌注進(jìn)行顯像檢測的局限而限制了其在監(jiān)測微小血管血流方面的運(yùn)用。SonoVue是新一代超聲造影劑，其采用磷脂包裹的微氣泡大小與紅細(xì)胞相仿，溶解在血液中能自由通過毛細(xì)血管，平均消除半衰期為12min，能在外周血液循環(huán)中持續(xù)較長時間，經(jīng)呼吸排泄無腎毒性。在低機(jī)械指數(shù)下，微泡能產(chǎn)生很好的非線性振動而不被破壞，從而使實(shí)質(zhì)器官血流得到有效的長時間連續(xù)增強(qiáng)顯像，特別是能較好地顯示細(xì)小和低速血流，結(jié)合TIC曲線可以定量分析血流灌注特征［4］。

實(shí)驗證明腎缺血再灌注24 h內(nèi)腎動脈可出現(xiàn)明顯的血流動力學(xué)變化［5］。本研究中，RIRI后2 h即觀察到TTP延長，β減低。TTP代表腎皮質(zhì)造影劑開始增強(qiáng)到達(dá)峰值的時間，β代表造影劑開始增強(qiáng)后的灌注速率［6］，在CEUS定量灌注參數(shù)中，RIRI各組間TTP和β出現(xiàn)顯著性差異，表明其是能動態(tài)反映腎皮質(zhì)灌注的敏感指標(biāo)。隨著缺血再灌注損傷的發(fā)展，腎臟自身調(diào)節(jié)失衡，腎組織內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活，腎皮質(zhì)合成前列環(huán)素減少和血栓素增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損致一氧化氮釋放減少及內(nèi)皮素釋放增加，共同導(dǎo)致腎小血管痙攣收縮；血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，表達(dá)多種炎癥介質(zhì)和促炎因子，如腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、血栓素A2（TXA2）等，促進(jìn)血小板和中性粒細(xì)胞沿血管內(nèi)皮滾動、黏附、聚集和外滲，導(dǎo)致腎微血管損傷，血管通透性增加造成組織水腫擠壓微血管，中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附，聚集，嵌頓，血小板及纖維蛋白形成微血栓栓塞毛細(xì)血管，共同造成無復(fù)流現(xiàn)象，導(dǎo)致微循環(huán)阻力增高，造影劑進(jìn)入腎毛細(xì)血管床的時間延長，表現(xiàn)為TTP延長，β降低。另外本實(shí)驗觀察到發(fā)生RIRI后TTP的延長和β的降低的程度隨時間延長而加重，在RIRI后第3 d達(dá)到高峰，在RIRI后第5 d則有所改善［7］。二者的動態(tài)變化與腎皮質(zhì)病理表現(xiàn)相關(guān)，表現(xiàn)在發(fā)生RIRI后，隨時間延長腎小管上皮細(xì)胞變性壞死和脫落，管腔擴(kuò)張，腎間質(zhì)水腫、炎細(xì)胞浸潤隨之加重，RIRI后第3 d最為顯著，而第5 d腎小管上皮細(xì)胞變性及壞死及間質(zhì)充血、水腫有所改善，表明RIRI后前3 d是一危險期，度過這一危險期后，隨著腎小管上皮細(xì)胞再生修復(fù)，微循環(huán)改善，反映在TIC曲線參數(shù)上TTP縮短，β值增高。

A值反映瞬時的感興趣區(qū)血流容積。于本實(shí)驗中觀察到A值在RIRI后第16 h后開始下降，第3 d下降最為顯著（R4組與R2組、R3組比較，P＜0.05）。結(jié)合病理考慮可能為血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，腎小動脈及腎小球毛細(xì)血管網(wǎng)內(nèi)有廣泛的纖維蛋白和血小板沉著，致使血管腔變窄，血流阻力增加，腎血流量明顯降低。而RIRI早期及后期A值與對照組相比無明顯變化，除考慮到早期腎微循環(huán)損傷較輕微及后期微循環(huán)改善導(dǎo)致腎血流量減少程度較低外，也與A值所表達(dá)的增強(qiáng)值是瞬間的，累積效應(yīng)不明顯相關(guān)。本實(shí)驗觀察到發(fā)生RIRI后AUC值較對照組增高，RIRI組間AUC并無顯著差異。這與RIRI引起的腎血流量減少的病理生理表現(xiàn)不符。RIRI后AUC增加與腎血流量減少相背離涉及腎臟血流動力學(xué)、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)的相互作用等諸多因素。分析原因為RIRI引起腎血流量減少，同時RIRI后皮質(zhì)灌注速度降低，微泡廓清速度減慢，導(dǎo)致造影劑在腎毛細(xì)血管網(wǎng)內(nèi)密度增加，此外RIRI后血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，大量的炎細(xì)胞趨化、淤滯于微血管及間質(zhì)內(nèi)，對微泡有吞噬作用，被吞噬的微泡依然保持聲學(xué)活性而仍能被檢測到。綜上所述AUC反映的是一定時間內(nèi)造影增強(qiáng)的累積效應(yīng)，微泡廓清速度減慢、炎細(xì)胞對造影劑的吞噬作用導(dǎo)致局部感興趣區(qū)一定時間內(nèi)微泡密度的增加，使AUC增高，不能真實(shí)反映腎皮質(zhì)的血流量。本實(shí)驗認(rèn)為A值和AUC對判斷腎組織的血流動力學(xué)的改變有一定的研究價值，但目前不能作為組織的血容量的定量指標(biāo)來進(jìn)行評估。

綜上所述，RIRI發(fā)生后前三天內(nèi)隨時間延長鏡下腎小管上皮細(xì)胞變性壞死，腎間質(zhì)水腫，炎細(xì)胞浸潤程度加重。腎微血管強(qiáng)烈收縮、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、白細(xì)胞淤滯，微血栓形成。RIRI后第三天腎皮質(zhì)損傷最為嚴(yán)重，而渡過這一“危險期”，部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)再生現(xiàn)象，新生毛細(xì)血管數(shù)量增多，腎皮質(zhì)微循環(huán)受損得以改善。CEUS定量分析技術(shù)能在早期即發(fā)現(xiàn)兔RIRI所致的腎血流灌注異常，并能動態(tài)反映RIRI后腎皮質(zhì)血流灌注的變化及轉(zhuǎn)歸。腎血流動力學(xué)與腎功能損傷是相互影響、相互作用的，若CEUS探測到RIRI后3 d內(nèi)腎皮質(zhì)出現(xiàn)明顯的血流動力學(xué)變化時應(yīng)考慮到腎損傷的存在，特別是TTP及β對指導(dǎo)臨床早期診治RIRI及評價療效有較大價值。

［1］余曉東，廖波，鄧顯忠，等.一種新型實(shí)用的大鼠腎缺血再灌注損傷模型的建立［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2011，40（13）：1283-1284.

［2］董怡，王文平，黃詠紅，等.健康實(shí)驗兔腎血流灌注超聲造影定量分析方法學(xué)研究 ［J］.中華醫(yī)學(xué)超聲雜志：電子版，2010，7（7）：1127-1133.

［3］Andonian S，Coulthard T，Smith AD，et al.Real-time quantitation of renal ischemia using targeted microbubbles：in-vivo measurement of P-selectin expression［J］.J Endourol，2009，23（3）：373-378.

［4］Kinns J，Aronson L，Hauptman J，et al.Contrast-enhanced ultrasound of the feline kidney［J］.Vet Radiol Ultrasound，2010，51（2）：168-172.

［5］陳曉梅，李明星，李昆萍，等.缺血再灌注的兔腎動脈阻力指數(shù)與腎組織TNF-α表達(dá)的相關(guān)性研究 ［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2011，40（34）：3474-3476.

［6］Leinonen MR，Raekallio MR，Vainio OM，et al.Quantitative contrast-enhanced ultrasonographic analysis of perfusion in the kidneys，liver，pancreas，small intestine，and mesenteric lymph nodes in healthy cats［J］.Am J Vet Res，2010，71（11）：1305-1311.

［7］李明星，葉帆，羅志建，等.超聲造影定量評價腎缺血再灌注損傷后兔腎皮質(zhì)血流動力學(xué)改變［J］.四川醫(yī)學(xué)，2013，34（12）：1769-1771.

Study on contrast-enhanced ultrasonography in quantitative evaluation of rabbit's cortex hemodynamics after renal ischemia reperfusion injury

YE Fan，LI Ming-xing，LUO Zhi-jian，CHEN Xiao-mei，XUAN Ji-qing
（The Affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou Sichuan 646000，China）

Objective：To explore the value of contrast-enhanced ultrasonography（CEUS）in quantitative evaluation of rabbit's cortex hemodynamic changes after renal ischemia reperfusion injury（RIRI）.Methods：All the 54 rabbits were randomly divided into control group and different time groups at 2 h，16 h，24 h，3 d，5 d after ischemia reperfusion.Using CEUS to observe the pattern of rabbits'renal perfusion and perfusion peak time（TTP），curve rising slope rate（β），amplitude of peak intensity（A），and area under the curve（AUC）.And researched the relativity between quantitative evaluation of rabbit's cortex hemodynamics by CEUS and renal pathologic changes.Result：Compared with control group，the TTP and AUC extend，β decreased after RIRI（P＜0.05）.TTP and β had difference in RIRI groups，while the most significant changes happened at 3 d after reperfusion（P＜0.01）.Compared with control group，the A decreased at 16 h，24 h，3 d after RIRI（P＜0.05），while the most significant changes happened at 3 d after reperfusion（P＜0.01）.Conclusion：CEUS combined with quantitative analysis can catch early the rabbit's cortex hemodynamic changes after RIRI.Renal cortex microcirculation suffered the most severe damage at 3 d after RIRI.It would get better while passed through the crisis.CEUS can reflect these changes sensitively.

Kidney；Reperfusion injury；Rabbits；Ultrasonography，Doppler，color；Urography

R334.1；R814.43

A

1008-1062（2015）06-0413-04

2014-11-03；

2014-11-17

葉帆（1986-），女，四川瀘州人，醫(yī)師。

四川省教育廳科研資助課題（項目編號：142A0139）。