張 韞， 高蘇亞

(西安醫(yī)學院藥學院，陜西西安 710021)

甲基多巴(Methyldopa)，化學名稱為L-3-(3,4-二羥基苯基)-2-甲基丙氨酸，主要用于治療中至重度原發(fā)性、腎性和惡性高血壓[1]。文獻已報道測定甲基多巴的方法有液相色譜法[2]、薄層色譜法[3]、分光光度法[4]、電化學法[5]、毛細管電泳法[6]、液質聯(lián)用法[7]和核磁共振法[8]等。這些方法存在或靈敏度低，或操作復雜，或儀器昂貴、分析成本高等問題。因此，研究一種靈敏度高且簡便快速的分析方法是十分必要的。

流動注射-化學發(fā)光法(Flow Injection-Chemiluminescence，FI-CL)具有靈敏度高、線性范圍寬、試劑消耗量少和分析速度快等優(yōu)點，在生物化學、藥物分析及臨床醫(yī)學等領域具有廣闊的應用前景。目前采用化學發(fā)光法測定甲基多巴的報道[9]較少。本實驗基于甲基多巴對魯米諾-肌紅蛋白體系化學發(fā)光信號的抑制作用，建立了流動注射-化學發(fā)光超靈敏測定甲基多巴的新方法，并成功應用于生物流體中甲基多巴含量的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

IFFM-E型流動注射化學發(fā)光分析儀(西安瑞邁分析儀器有限責任公司)。

圖1 流動注射-化學發(fā)光實驗裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of the FI-CL system

魯米諾(純度≥97%,Sigma-Aldrich)儲備液濃度為2.5×10-2mol/L；肌紅蛋白(分子量17.2 kDa,Sigma-Aldrich)儲備液濃度為5.0×10-5mol/L；甲基多巴(中國食品藥品檢定研究院)儲備液濃度為1.0×10-4g/mL；以上儲備液均于4 ℃保存。其它試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水，經艾柯KLZ-UV超純水機(成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司)純化。

1.2 實驗方法

本實驗裝置由四條管路組成：魯米諾(NaOH)、肌紅蛋白、載液(超純水)和甲基多巴樣品溶液(圖1)。泵流速為2.0 mL/min，待基線穩(wěn)定，由六通閥定量注入的100 μL魯米諾與肌紅蛋白和甲基多巴樣品液的混合液再混合后，在堿性條件下流入流通池。所產生的化學發(fā)光信號由光電倍增管(HV：-750 V)檢測，再經IFFE-E型數據分析系統(tǒng)記錄處理。

2 結果和討論

2.1 實驗條件的優(yōu)化

實驗對混合管長度以及溶液流速分別在9.0～19.0 cm和0.5～5.0 mL/min范圍內進行了優(yōu)化。綜合考慮溶液混合效果及發(fā)光強度等因素，選定溶液流速為2.0 mL/min,混合管長度為10.0 cm?？疾炝唆斆字Z溶液濃度在5.0×10-7～5.0×10-4mol/L范圍內對體系化學發(fā)光信號的影響。當魯米諾濃度為2.5×10-5mol/L時化學發(fā)光信號強而穩(wěn)定，故以此濃度作為魯米諾的實驗濃度。

魯米諾化學發(fā)光反應在pH為10～11條件下發(fā)光強度最大。因此在魯米諾溶液中加入NaOH以提高化學發(fā)光反應的靈敏度。魯米諾濃度為2.5×10-5mol/L時，對NaOH濃度在1.0×10-3～1.0×10-1mol/L范圍內進行了優(yōu)化實驗。結果表明，NaOH濃度為2.5×10-2mol/L時魯米諾化學發(fā)光體系的信號達到最大值，故實驗選擇NaOH的濃度為2.5×10-2mol/L。

研究表明肌紅蛋白可以增敏魯米諾體系的化學發(fā)光信號。考察了肌紅蛋白在1.0×10-9～1.0×10-7mol/L范圍內對體系發(fā)光信號的影響。實驗發(fā)現隨著肌紅蛋白濃度的增大，發(fā)光信號相應增強，當濃度為1.0×10-8mol/L時發(fā)光信號趨于穩(wěn)定。故選擇肌紅蛋白的實驗濃度為1.0×10-8mol/L。

2.2 化學發(fā)光強度與反應時間的關系

圖2 不同體系的化學發(fā)光強度-時間曲線Fig.2 CL intensity-time cuves of different systems1:luminol;2:luminol-myoglobin-methyldopa;3:luminol-myoglobin.

在流動注射系統(tǒng)中對魯米諾-肌紅蛋白-甲基多巴的化學發(fā)光行為進行了考察(圖2)。實驗中肌紅蛋白、魯米諾和NaOH濃度分別為1.0×10-8、2.5×10-5和2.5×10-2mol/L。由圖2曲線1可知，魯米諾體系在4.8 s(tmax)時發(fā)光強度達到最大值(Imax)124，且信號在18 s內消失；加入肌紅蛋白后，體系的Imax增大至352，相應的tmax縮短為4.2 s(曲線3)。當1.0×102pg/mL甲基多巴存在時，Imax從352降至265，降低了25%，而tmax不變(曲線2)。

2.3 化學發(fā)光體系穩(wěn)定性測試

對不同濃度甲基多巴存在下魯米諾-肌紅蛋白化學發(fā)光體系的穩(wěn)定性進行了測試。將100 μL魯米諾注入流動注射分析系統(tǒng)，記錄化學發(fā)光信號來測試不同體系的穩(wěn)定性。每個結果為7次進樣測定的平均值。該實驗持續(xù)3 d，系統(tǒng)每天運行8 h，結果顯示，相對標準偏差(RSD)值均小于3.0%，可見該發(fā)光體系呈現良好的穩(wěn)定性。

2.4 線性范圍、檢出限和相對標準偏差

實驗發(fā)現魯米諾-肌紅蛋白體系化學發(fā)光信號降低值(△I=Io-Is，Io和Is分別為不存在和存在甲基多巴時體系的化學發(fā)光強度)與甲基多巴濃度(3.0～3.0×103pg/mL)的對數值存在良好的線性關系，線性方程為：△I=17.3lnc+3.47(c：pg/mL)，相關系數R=0.9965，檢出限(3σ)為1.0 pg/mL。在流速2.0 mL/min條件下，完成一次測定(包括進樣和沖洗管路)僅需36 s，采樣頻率達100/h。

2.5 干擾實驗

2.6 樣品分析

血清樣品來源于陜西省人民醫(yī)院，唾液和尿液樣品由健康志愿者提供。實驗采用標準加入法測定甲基多巴含量，結果分別列于表1、表2和表3，回收率為96.3%～104.1%，RSD均小于3.5%(n=7)。本法可成功用于人體唾液、尿液及血清中甲基多巴含量的測定。

表1 人體唾液中甲基多巴的含量測定(n=7)

表2 人體尿液中甲基多巴的含量測定(n=7)

表3 人體血清中甲基多巴的含量測定(n=7)

3 結論

本文以甲基多巴對魯米諾-肌紅蛋白體系化學發(fā)光的猝滅作用為基礎，結合流動注射分析技術，建立了快速靈敏測定甲基多巴的新方法。本法具有靈敏度高、線性范圍寬、分析速度快、試劑消耗少和儀器裝置簡單等優(yōu)點，對生物流體中甲基多巴的分析測定及臨床監(jiān)測具有一定的意義。