史維剛，廖鮮艷，翁新楚

（上海大學生命科學學院，上海 200444）

丹參酮ⅡA對UVA誘導的HaCaT細胞凋亡的影響

史維剛，廖鮮艷，翁新楚

（上海大學生命科學學院，上海 200444）

以人自發(fā)性永生化角質(zhì)形成細胞系（HaCaT）細胞為材料，通過CCK8和蛋白印跡法分別測定不同劑量長波紫外線（ultraviolet A，UVA）、不同濃度丹參酮ⅡA（tanshinoneⅡA，TSⅡA），以及UVA和TSⅡA共同作用下的細胞活力和促分裂素原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號通路蛋白（p38，JNK和Erk）磷酸化水平.結(jié)果表明：在10 J/cm2的UVA照射下，細胞活力為對照組的70%左右，在20 J/cm2的UVA照射下，細胞活力僅為對照組的55%左右；低濃度的TSⅡA在正常情況下對細胞活力無影響，高濃度（85μmol/L）TSⅡA處理組的細胞活力約為對照組的70%左右.與TSⅡA或UVA單獨處理相比，二者共同作用下細胞活力大大降低且差異極其顯著.UVA照射提高了MAPK信號通路中的p38和JNK磷酸化水平，但是對Erk磷酸化水平?jīng)]有影響；而TSⅡA可以顯著提高低輻射劑量（2 J/cm2）UVA誘導下的p38和JNK的磷酸化水平.這說明UVA促進HaCaT細胞凋亡是通過提高p38和JNK磷酸化水平來實現(xiàn)的；而TSⅡA可以提高p38和JNK磷酸化水平，進一步加速UVA誘導的HaCaT細胞凋亡.

丹參酮ⅡA（tanshinoneⅡA，TSⅡA）；長波紫外線（ultraviolet A，UVA）；HaCaT；促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）；凋亡

皮膚癌是目前世界范圍內(nèi)十分普遍的疾病，嚴重威脅人類的健康.據(jù)報道，6個美國人中就有1個在一生中可能患皮膚癌［1］.非黑素性皮膚癌患者在皮膚癌患者中的比例超過了1/3，并且以每年大約6 000 000的人數(shù)增長［2］.中國的皮膚癌發(fā)病率，男性為0.3%～0.4%，女性約為0.3%，其中較大的人口基數(shù)意味著絕對新發(fā)病例數(shù)目同樣不容忽視［3］.

皮膚癌的主要誘因是紫外線［4］.紫外線按波長可分為短波紫外線（ultraviolet C，UVC），波長為200～290 nm；中波紫外線（ultraviolet B，UVB），波長為290～320 nm；長波紫外線（ultraviolet A，UVA），波長為320～400 nm.地球上空的臭氧層可以吸收的紫外線波長最大到310 nm，所以照射到皮膚上的紫外線以UVA居多［5］.角質(zhì)形成細胞是皮膚表層最主要的細胞，其健康程度直接影響著其他皮膚細胞的功能和狀態(tài).UVA對角質(zhì)形成細胞的影響在國外研究較多.一般認為UVA的致癌作用，一方面是因為其在細胞中產(chǎn)生的單線氧（1O2）和氧自由基（reactive oxygen species，ROS）引起的核酸氧化損傷、蛋白質(zhì)的氧化和脂質(zhì)過氧化；另一方面，UVA可以激活多種膜受體，并引發(fā)癌變或凋亡相關信號通路的轉(zhuǎn)導.郭坤等［6］報道了UVA對HaCaT細胞的氧化損傷作用，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過UVA照射后細胞中的ROS含量明顯上升，導致超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）活性下降.陳斌等［7］研究了UVA和UVB對細胞骨架的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)UVA/UVB照射后5種角蛋白（keratin）中的K7，K8，K13，K18和K19發(fā)生變化，這些骨架蛋白的變化不僅與皮膚細胞形態(tài)有關，還可能進一步參與細胞凋亡及癌變.

TSⅡA是從傳統(tǒng)中藥丹參根中提取的菲醌類衍生物，分子式為C19O3H20［8］，經(jīng)常用于心絞痛的治療，能改善胸悶和缺氧后引起的心肌代謝紊亂［9］.國內(nèi)的有關研究表明，TSⅡA可以抑制肝癌細胞的增殖［10］，誘導乳腺癌細胞的凋亡［11］.韓國的Jang等［12］發(fā)現(xiàn)TSⅡA在小鼠巨噬細胞RAW264.7中通過NF-κB誘導激酶—IκB激酶途徑和MAPK信號通路降低NF-κB的活性，具有一定的抗炎作用.日本的Dai等［13］研究發(fā)現(xiàn)，TSⅡA可以提高肝癌細胞BEL-7402胞內(nèi)的鈣離子水平，并通過鈣離子依賴的信號通路誘導癌細胞凋亡.然而，TSⅡA在皮膚癌治療方面的應用鮮有報道.本研究擬通過比較在UVA和TSⅡA單獨作用，以及二者共同作用下HaCaT細胞的凋亡水平和凋亡信號通路相關蛋白磷酸化水平，探究TSⅡA促進UVA誘導的細胞凋亡機制.

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1試劑

TSⅡA（中國藥品生物制品檢定所）；DMEM（dulbecco's modified eagle medium）培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司）；細胞增殖-毒性檢測試劑盒（CCK8，同仁化學）；細胞裂解液（Sigma公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（Pierce）；預制膠（Bio-Rad公司）；PVDF預制膜（Bio-Rad公司）；顯色劑（Bio-Rad公司）；蛋白印跡膜再生液（Thermo Meter）；磷酸化p38、磷酸化JNK、磷酸化Erk（P-p38，P-JNK，P-Erk）及總p38、總JNK、總Erk抗體及其對應的二抗（辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG抗體，Cell Signaling公司）；β-actin抗體及其對應的二抗（辣根過氧化酶標記羊抗鼠IgG抗體，Cell Signaling公司）.

1.1.2儀器

紫外輻照儀CL-1000（燈管波長為365 nm）及輻照強度計（美國UVP公司）；酶標儀（Tecan Safire 2）；生物分子成像儀（GE ImageQuant LAS 500）；垂直電泳儀（Mini-Protean Tetra）、蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（Trans-Blot Turbo）均購于美國Bio-Rad公司.

1.1.3細胞

HaCaT細胞購于武漢原生原代（PriCells）生物醫(yī)藥科技有限公司.

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組

HaCaT細胞培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)基（DMEM加10%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）于37?C，5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，細胞以0.25%胰酶消化并按1∶3傳代.HaCaT細胞接種于12孔板，待細胞完全融合時進行實驗并隨機分組，每組做3個重復.在測定UVA對細胞活力和MAPK信號通路蛋白影響的實驗中按UVA劑量分組；在評價TSⅡA對細胞活力影響的實驗中按濃度分組；在TSⅡA和UVA共同對細胞活力影響的實驗中，分為對照組、僅TSⅡA處理組、僅UVA照射組、TSⅡA和UVA共同處理組來研究細胞活力水平及p38和JNK的磷酸化水平.

1.2.2UVA照射

照射時棄去培養(yǎng)基，用DPBS（dulbecco phosphate-buffered saline）沖洗2次并棄去DPBS；重新向所有孔中加入0.5 mL DPBS.細胞培養(yǎng)板距紫外燈管15 cm，并置于紫外輻照儀內(nèi)部中央.紫外強度（J/cm2）=單位面積瓦特值（W/cm2）×時間（s）.照射時，對照組和僅TSⅡA處理組用錫箔紙蓋住，照射后DPBS由常規(guī)完全培養(yǎng)基或者加有TSⅡA的完全培養(yǎng)基替換并繼續(xù)培養(yǎng).

1.2.3TSⅡA處理

將TSⅡA溶于二甲基亞砜，用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋到所需濃度.HaCaT細胞常規(guī)完全培養(yǎng)基更換為含有不同濃度TSⅡA的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在37?C，5%CO2的條件下培養(yǎng)24 h.在測定細胞活力的實驗中，TSⅡA在UVA照射后加入對應細胞組；在測定MAPK信號通路蛋白水平的實驗中，TSⅡA在UVA照射前24 h加入對應細胞組.

1.2.4細胞活力的測定

細胞活力由CCK8（cell counting kit-8）測定.處理后的細胞經(jīng)過常規(guī)培養(yǎng)24 h后，用DPBS沖洗2次并棄去DPBS，每個孔加入0.5 mL混有CCK8的完全培養(yǎng)基（m（CCK8）∶m（DMEM）=1∶10）于37?C，5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng).2 h后每個孔吸取100μL上清至96孔板，在450 nm的波長下讀取吸光值，以對照組為100%細胞活力計算相對細胞活力.

1.2.5蛋白質(zhì)印跡法檢測磷酸化水平及總MAPK信號通路蛋白

檢測UVA對MAPK信號通路蛋白磷酸化影響：①不同劑量UVA照射后30 min，用預冷的DPBS沖洗3次并棄去DPBS，然后每個孔加入300μL的細胞裂解液搖晃15 min，并用細胞刮刀刮下置于1.5 mL的離心管內(nèi)，以12 000r/min的速度離心15 min，收集上清；②用蛋白濃度測定試劑盒測樣品蛋白質(zhì)濃度，在預制膠上每孔上樣20μg蛋白質(zhì)，10% SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyarcylamide gel electropheresis）電泳，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF（polyvinylidene fluoride）膜；③PVDF膜用封閉液TBST（tris buffered saline with tween）（1×TBS，0.1%Tween 20）+5%牛血清室溫封閉1 h，加入P-p38，P-JNK和P-Erk抗體（1∶1 000）4?C孵育過夜，TBST洗3次，每次5 min，加入對應的羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h；④PVDF膜用TBST洗3次，每次5 min，加顯色劑反應3 min后置于生物分子成像儀上顯色；⑤PVDF膜用TBST洗3次，并用蛋白印跡膜再生液浸泡15 min.重復③和④，其中步驟③加入總p38、總JNK和總Erk抗體及其對應的羊抗兔二抗或β-actin抗體及其對應的羊抗鼠二抗.顯色圖像采用Image J軟件分析灰度值，并用P-p38/β-actin，P-JNK/β-actin和P-Erk/β-actin衡量其磷酸化水平.

檢測TSⅡA和UVA共同對MAPK通路蛋白中P-p38和P-JNK表達水平的影響：僅在TSⅡA處理組、TSⅡA和UVA共同處理組中分別加入含有不同濃度TSⅡA的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，用2 J/cm2UVA照射細胞；照射后30 min，分別提取總蛋白并檢測目標蛋白的表達水平.除不加入P-Erk和總Erk抗體及其對應二抗外，其余步驟同上.

1.2.6數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計軟件JMP 11.0（美國SAS研究所）進行統(tǒng)計學分析.所有數(shù)據(jù)均用mean±SE表示，兩組間均數(shù)比較通過方差分析（anlysis of variance，ANOVA）進行，兩兩間均數(shù)比較通過Dunnett和Tukey校正進行，分別與對照組和任意處理組進行對比，其中P＜0.05表示差異具有顯著性，P＜0.01表示差異性極顯著.

2　結(jié)果

2.1UVA對HaCaT細胞活力的影響

HaCaT細胞經(jīng)受不同劑量UVA照射后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用CCK8測定細胞活力.UVA對HaCaT細胞活力的影響如圖1所示.可以發(fā)現(xiàn)，細胞活力表現(xiàn)出較大的差異且與UVA劑量相關，其中較低劑量（1～5 J/cm2）的UVA使細胞活力下降不明顯，較高劑量的UVA使細胞活力下降較大.當UVA的劑量為10 J/cm2和20 J/cm2時，細胞活力分別是對照組的70%左右和55%左右.這說明UVA對HaCaT細胞具有一定的殺傷力，且隨著劑量的加大，殺傷力逐漸增強.

圖1　UVA對HaCaT細胞活力的影響Fig.1 Effects of UVA on cell viability in HaCaT

2.2TSⅡA對HaCaT細胞活力的影響

將HaCaT細胞用含有不同濃度TSⅡA的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，用CCK8測定細胞活力. TSⅡA對HaCaT細胞活力的影響如圖2所示.由圖2可知，低濃度（8.5～34μmol/L）的TSⅡA對細胞活力幾乎無影響，隨著TSⅡA濃度的提高，細胞活力逐漸降低；42.5μmol/L的TSⅡA可使細胞活力輕微下降；高濃度（85.0μmol/L）的TSⅡA對細胞活力影響較大，細胞活力約為對照組的70%.

圖2　TSⅡA對HaCaT細胞活力的影響Fig.2 Effects of TSⅡA on cell viability in HaCaT

2.3TSⅡA和UVA共同對HaCaT細胞活力的影響

HaCaT細胞分別經(jīng)過20 J/cm2和2 J/cm2的UVA照射后，用含有不同濃度TSⅡA的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用CCK8測定細胞活力.TSⅡA對UVA誘導的HaCaT細胞活力的影響如圖3所示.

由圖3（a）可知，在20 J/cm2的UVA作用后添加TSⅡA的細胞，與僅UVA照射的細胞相比，細胞活力顯著降低且隨著TSⅡA濃度的升高而下降.添加了8.5，17.0，34.0μmol/L TSⅡA的細胞，其活力分別約為僅UVA照射細胞的66%，56%和40%.而由圖2可知，低濃度的TSⅡA對細胞活力無明顯影響，這說明高濃度TSⅡA加劇了UVA照射后細胞活力的下降.

由圖3（b）可知，2 J/cm2UVA對HaCaT細胞活力的影響情況與20 J/cm2UVA類似：TSⅡA均可以加劇UVA誘導的細胞活力的下降，且其程度與TSⅡA濃度相關.與僅UVA照射的細胞相比，經(jīng)8.5μmol/L TSⅡA處理過的細胞，其活力沒有顯著變化；經(jīng)17.0μmol/L TSⅡA處理過的細胞，其活力下降了20%；經(jīng)34.0μmol/L TSⅡA處理過的細胞，其活力更是下降了33%.

綜上所述，無論是經(jīng)高劑量還是低劑量UVA照射，TSⅡA都可以進一步使細胞活力下降，二者具有疊加效應.

圖3　TSⅡA對UVA誘導的HaCaT細胞活力的影響Fig.3 Effects of TSⅡA on cell viability in UVA-induced HaCaT

2.4UVA對MAPK通路蛋白表達水平的影響

HaCaT細胞經(jīng)不同劑量的UVA照射后30 min提取總蛋白，并用蛋白印跡法測定目標蛋白表達水平，結(jié)果如圖4所示.可以看出，細胞經(jīng)UVA照射后P-p38和P-JNK的表達水平顯著上升，且二者的表達水平與照射劑量呈正相關.在2 J/cm2的UVA作用下，P-p38/βactin約為2.3，P-JNK/β-actin約為3.0；在20 J/cm2的UVA作用下，P-p38/β-actin約為3.3，P-JNK/β-actin約為3.8.不同劑量的UVA照射對HaCaT細胞的P-Erk表達沒有顯著影響，這與文獻［14］中的報道一致，即總p38、總JNK和總Erk在細胞經(jīng)不同劑量的UVA照射后均無明顯變化.

圖4　UVA對HaCaT細胞MAPK通路蛋白磷酸化水平的影響Fig.4 Effects of UVA on phosphorylation of proteins in MAPK of HaCaT

2.5TSⅡA和UVA共同對MAPK通路蛋白中P-p38和P-JNK表達水平的影響

HaCaT細胞經(jīng)不同濃度TSⅡA處理24 h后，部分組細胞用2 J/cm2的UVA照射，30min后對所有組細胞提取總蛋白，并用蛋白印跡法測定目標蛋白表達水平.TSⅡA和UVA共同作用對P-p38和P-JNK表達水平的影響如表1所示.

表1　TSⅡA和UVA對P-p38和P-JNK表達水平的影響Table 1 Effects of TSⅡA and UVA on P-p38 and P-JNK

由表1可以看出，HaCaT細胞在用不同濃度TSⅡA培養(yǎng)24 h而未經(jīng)UVA照射的情況下，其P-p38和P-JNK的表達水平無明顯變化，總p38和總JNK基本不變.這說明TSⅡA在正常情況下不會引起p38和JNK的激活，不會介導HaCaT細胞的凋亡.

TSⅡA的預處理使照射UVA的細胞中P-p38和P-JNK的表達水平均有不同程度的提高，其中P-p38表達水平隨著TSⅡA濃度的提高而上升，而P-JNK表達水平則在較高的TSⅡA濃度下急劇上升.當TSⅡA和UVA共同處理組中TSⅡA的濃度達到34.0μmol/L時，通路蛋白中P-p38和P-JNK的表達水平均較高，其中P-p38/β-actin和P-JNK/β-actin分別為4.4和38.8，與僅UVA照射組（P-p38/β-actin和P-JNK/β-actin分別為2.0和8.8）相比，二者的表達水平分別提高約2.2和4.4倍.

3　討論

UVA使HaCaT細胞活力下降是因為其誘導了細胞凋亡，原因有以下幾點：①UVA的輻射引起DNA的損傷，導致Fas上調(diào)和FasL（fas ligand）表達增加，其機制可能與JNK相關.Fas是一種死亡受體，通過結(jié)合配體FasL而激發(fā)細胞凋亡［15］.②UVA刺激產(chǎn)生的ROS（reactive oxygon species）可以直接激活MAPK信號通路［16］.③UVA可以直接激活細胞膜上的生長因子受體和死亡受體，激活的受體可以進一步介導下游的癌變或凋亡通路，最主要的是MAPK信號通路［17］.低濃度的TSⅡA在正常情況下對細胞活力無影響，只有達到一定濃度（85μmol/L）時才會對細胞活力產(chǎn)生影響，這表明在一定濃度范圍內(nèi)，TSⅡA添加到皮膚保護用品中對皮膚是比較安全的.TSⅡA加劇了UVA誘導的HaCaT細胞活力下降可能是因為其促進了UVA誘導的細胞凋亡.

MAPK信號通路是真核生物信號傳導網(wǎng)絡中的重要途徑之一，其主要有3個亞族：p38，JNK和Erk，它們分別或共同對細胞的增殖和凋亡產(chǎn)生作用.Erk包括p42和p44兩個亞基（見圖4（c）），主要被生長和分化因子刺激而激活；JNK包括p46和p54兩個亞基（見圖4（b）），除了生長因子外，外界的刺激也會使其激活，比如紫外線和炎癥因子；p38主要被外界的刺激所激活［18］.一些學者在P-12細胞株中發(fā)現(xiàn)凋亡過程與MAPK信號通路密切相關，p38和JNK被磷酸化而激活會導致細胞的凋亡，而Erk的激活則不會導致細胞凋亡，反而會使細胞存活下來［19］.激活后的P-p38和P-JNK由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)分別介導轉(zhuǎn)錄因子Max，CREB（cAMP-response element binding protein）和c-jun的活化，共同介導轉(zhuǎn)錄因子ATF2（activating transoription factor 2），Elk1的活化，最終引起細胞的凋亡［20］.被UVA損傷但沒有凋亡的細胞會有很大可能轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒约毎?，促進UVA損傷的細胞凋亡可能是治療皮膚癌的有效手段之一.本研究結(jié)果表明，UVA作為外界刺激，可以有效地提高p38和JNK磷酸化水平，但不會導致MAPK通路蛋白總量的增加或減少.因此可以推斷，在MAPK通路蛋白總量不變的情況下，UVA的照射導致細胞活力下降是由于UVA誘導細胞凋亡導致的直接結(jié)果［21］.

TSⅡA使照射UVA的HaCaT細胞進一步凋亡，并致使細胞中的p38和JNK磷酸化水平大大提高，這說明TSⅡA促進UVA誘導的HaCaT細胞凋亡是通過p38和JNK及其下游信號通路介導實現(xiàn)的.已有研究表明，TSⅡA誘導胃癌細胞MKN-45凋亡可能是通過抑制bcl-2的表達和促進p53的表達來實現(xiàn)的［22］.何金濤等［23］也發(fā)現(xiàn)TSⅡA可以通過上調(diào)p53，p21的表達及下調(diào)CDKN2（cyclin dependent kinase inhivitor）的表達來抑制人肺腺癌細胞株SPCA-1增殖.這些抑癌基因和促進凋亡基因的表達也嚴格受p38和JNK的調(diào)控.此機制的發(fā)現(xiàn)對TSⅡA關于腫瘤的治療作用具有重要意義，但是TSⅡA作用于損傷或者癌變細胞的初始靶點需要在MAPK信號通路上游繼續(xù)尋找.

4　結(jié)束語

本研究為TSⅡA用于皮膚癌的治療提供了新方法和一定的理論依據(jù).雖然TSⅡA可以進一步提高UVA誘導的p38和JNK的磷酸化水平，但是尚不能完全確認MAPK通路是TSⅡA促進UVA誘導角質(zhì)形成細胞凋亡的介導信號，還需要用通路抑制/敲除實驗來進一步驗證.

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Effect of tanshinoneⅡA on UVA-induced apoptosis of HaCaT

SHI Wei-gang，LIAO Xian-yan，WENG Xin-chu
（School of Life Sciences，Shanghai University，Shanghai 200444，China）

Human immortalized keratinocytes（HaCaT）were used as materials and effects of ultraviolet A（UVA），tanshinoneⅡA（TSⅡA），and combination of UVA and TSⅡA on cell viability and mitogen-activated protein kinase（MAPK）signaling protein phosphorylation were studied using CCK8 and Western blot respectively.The results showed that UVA at 10 J/cm2lowered cell viability to about 70%of that of control，while 20 J/cm2dose led to further reduction to about 55%.Low concentration TSⅡA had no impact on cell viability，and high concentration TSⅡA（85μmol/L）could decrease cell viability to 75%. When combined together，UVA and TSⅡA significantly exhibited together inhibitory effect on cell viability compared to their individual effects.UVA irradiation elevated the phosphorylation level of p38 and JNK in MAPK cascade，but had no effect on phosphorylation of Erk.TSⅡA could promote phosphorylation of p38 and JNK induced by lowdose UVA（2 J/cm2）.The above results indicate that UVA induces HaCaT apoptosis by promoting phosphorylation of p38 and JNK，and in turn，TSⅡA further promotes its phosphorylation and accelerated HaCaT apoptosis.

tanshinoneⅡA（TSⅡA）；ultraviolet A（UVA）；HaCaT；mitogen-activated protein kinase（MAPK）；apoptosis

R 285

A

1007-2861（2015）06-0757-09

10.3969/j.issn.1007-2861.2014.05.004

2014-05-15

翁新楚（1962—），男，教授，博士生導師，研究方向為天然產(chǎn)物的開發(fā)與利用等. E-mail：wxch@staff.shu.edu.cn