楊國慧等

摘要：以樹莓（Rubus idaeus L.）品種美國22、歐洲紅、金秋、黑樹莓為試材，于2013年5～8月采集結(jié)果枝和根蘗苗中部葉片、青果、熟果，利用超聲波法和 NaNO2-Al（NO3）3比色法測定黃酮類化合物含量。結(jié)果表明，4個品種葉片的黃酮類化合物含量均在6月末最高，歐洲紅和美國22結(jié)果枝葉片的高于根蘗苗葉片；青果高于熟果，品種間的含量高低為金秋、美國22、歐洲紅、黑樹莓，同一品種葉片的黃酮類化合物含量高于果實。葉片的黃酮類化合物對4種自由基（·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·）的清除能力均在6月末最強，青果高于熟果和葉片，青果中金秋的清除能力最強。

關(guān)鍵詞：樹莓（Rubus idaeus L.）；葉片；果實；黃酮類化合物；抗氧化性

中圖分類號：S663.2；Q944.5；Q946.83 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4514-05

樹莓（Rubus idaeus L.）為適合在寒地栽培的一種特色小漿果類果樹，據(jù)報道，樹莓的葉片與果實中均富含黃酮類化合物[1]。目前關(guān)于樹莓黃酮類化合物的研究所采用的試驗材料其果實主要以紅樹莓為主，而葉片則采用成熟葉片。樹莓果實除紅色果之外，還有紫、黃、黑色果等類型；而葉片顏色在一年的生長期里會呈現(xiàn)出季節(jié)性的動態(tài)變化。樹莓不同顏色的果實、不同季節(jié)的葉片、葉片和果實之間黃酮類化合物的含量與抗氧化性是否存在著差異，目前尚未見研究報道。試驗通過對樹莓不同品種、不同發(fā)育時期的葉片和果實中黃酮類化合物的含量與抗氧化性進(jìn)行分析，旨在進(jìn)一步豐富其生理活性物質(zhì)的研究內(nèi)容，拓寬樹莓的開發(fā)利用渠道[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

以果實顏色紫色為的樹莓品種美國22（R. idaeus cv. American 22）、紅色的歐洲紅（R. idaeus cv. European Red）、黃色的金秋（R. idaeus cv. Fall Gold）、黑色的黑樹莓（R. idaeus cv. Black Raspberry）為試驗材料，其中美國22、歐洲紅、金秋3個品種采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊試驗農(nóng)場，黑樹莓采自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院綏棱漿果所試驗基地[3]。美國22和歐洲紅越冬埋土，金秋和黑樹莓于春季萌芽前進(jìn)行平茬處理。分別于2013年5～8月底采集4 個品種結(jié)果枝和根蘗苗中部位置的葉片，以及各自的青果和成熟的果實，采后冷藏于冰箱內(nèi)備用。

試劑主要有乙醇、乙酸乙酯、石油醚、NaNO2、AlNO3、FeSO4、水楊酸、H2O2、HCl、Tris-HCl緩沖液、鄰苯三酚、過硫酸鉀等，都為分析純，總抗氧化能力檢測試劑2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）為化學(xué)純，蘆丁為參照標(biāo)準(zhǔn)品（大連博邁科技發(fā)展有限公司）。

儀器主要有T6新悅型紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）、KQ3200 DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）以及電子天平、微型真空泵、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等。

1.2 方法

1.2.1 樹莓黃酮類化合物的提取與測定 分別稱取葉片組織2 g、果實組織5 g，按1∶12和1∶10（g/mL）的比例加入95%乙醇，采用超聲波儀在100 W下各提取3 次，每次30 min，真空泵減壓過濾。將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用乙酸乙酯萃取至下層水相無色透明，其中葉片再用石油醚萃取（去脂、去葉綠素）。取萃取液再次進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，之后用95%乙醇定容得到黃酮類化合物提取物。以蘆丁為參照標(biāo)準(zhǔn)品（大連博邁科技發(fā)展有限公司），采用 NaNO2-Al（NO3）3比色法來測定黃酮類化合物的含量，測定波長為510 nm[4]。

1.2.2 樹莓黃酮類化合物抗氧化性分析 ①羥自由基·OH清除能力的測定。在試管中加入1.00 mL黃酮類化合物提取液、2.00 mL FeSO4（0.2 mmol/mL）溶液、1.50 mL水楊酸-乙醇（0.2 mmol/mL），最后加0.10 mL H2O2（0.03%），振蕩混合，37 ℃水浴下保溫30 min，于510 nm波長下測定吸光度A1。加入黃酮類化合物提取液，不加H2O2，測定其對比吸光度A2。以蒸餾水1.00 mL代替黃酮類化合物提取液，測定空白吸光度A0[5]。②超氧自由基O2-·清除能力的測定。采用Marklund法。向2.8 mL、pH 8.2的 Tris-HCl（50 mmol/L）緩沖液中加入黃酮類化合物提取液0.1 mL，25 ℃下保溫10 min，然后加入0.1 mL 25 ℃下預(yù)溫的鄰苯三酚（60 mmol/L），搖勻，于420 nm處測吸光度 A1。以0.1 mL HCl（60 mmol/L）溶液代替鄰苯三酚（60 mmol/L），此吸光度記為A2，以蒸餾水為空白對照[6]，測定空白吸光度A0。③自由基ABTS·清除能力的測定。精密稱取 ABTS 40.00 mg，加入10 mL蒸餾水，加入1.0 mg/mL的過硫酸鉀8.00 mL，黑暗下放置16 h，之后將其轉(zhuǎn)移到容量瓶中，加蒸餾水32 mL，用無水乙醇定容至250 mL，放置10 h測定[7]。加0.5 mL黃酮類化合物提取液，然后加入1.5 mL 95%乙醇補至2 mL，再加入2 mL的 ABTS溶液混合，靜置30 min，734 nm下測吸光度 A1。以2 mL水代替ABTS溶液，測吸光度A2。以95%乙醇代替黃酮類化合物提取液，測定空白吸光度值A(chǔ)0[8-10]。④自由基DPPH·清除能力的測定。加入黃酮類化合物提取液0.2 mL，加入DPPH·乙醇溶液（25 μg/mL）2.8 mL，于515 nm處測定吸光度A1，直到讀數(shù)穩(wěn)定[11]。以2.8 mL 95%乙醇溶液代替DPPH·乙醇溶液，測定吸光度A2。以0.2 mL95%乙醇代替黃酮類化合物提取液，測定空白吸光度A0[12]。

樹莓黃酮類化合物提取液對上述4種自由基的清除能力（SA）可表示為：

SA（%）=[1-（A1-A2）/A0）]×100%，

式中，A0為空白吸光度；A1為加入黃酮類化合物溶液反應(yīng)的吸光度；A2為加入黃酮類化合物溶液未反應(yīng)的本底吸光度。

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0與Microsoft Office Excel 2003軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹莓葉片、果實中黃酮類化合物在不同生長期含量的比較

4個樹莓品種歐洲紅、美國22、金秋、黑樹莓結(jié)果枝葉片黃酮類化合物含量在不同生長期的測定結(jié)果見圖1。從圖1可見，4個樹莓品種結(jié)果枝葉片黃酮類化合物含量在不同生長時期均表現(xiàn)出一致的變化趨勢，即6月>7月>8月>5月（黑樹莓平茬后從6月末采摘）；而不同樹莓品種葉片在同一生長期內(nèi)的含量亦有差異，其中6月末是歐洲紅的含量最高，其結(jié)果枝葉片的黃酮類化合物含量達(dá)到3.7 mg/g。

2個夏果型樹莓品種（歐洲紅、美國22）根蘗苗葉片黃酮類化合物含量在不同生長期的測定結(jié)果見圖2。從圖2可見，歐洲紅和美國22的根蘗苗葉片黃酮類化合物含量亦是在6月末最高，但2個品種根蘗苗葉片的黃酮類化合物含量均低于其結(jié)果枝葉片的含量。

4個樹莓品種的青果和熟果果實中黃酮類化合物含量的測定結(jié)果見圖3。從圖3可見，4個樹莓品種的青果果實中黃酮類化合物含量均明顯大于熟果。且不論青果還是熟果，其黃酮類化合物含量均是金秋>美國22>歐洲紅>黑樹莓。

選取4個樹莓品種黃酮類化合物含量最高時期（6月末）的結(jié)果枝葉片、根蘗苗葉片、青果和熟果果實進(jìn)行比較，結(jié)果見圖4。從圖4可見，4個樹莓品種在6月末的葉片黃酮類化合物含量均大大高于果實的黃酮類化合物含量。

2.2 樹莓葉片、果實中黃酮類化合物的抗氧化性比較

4個樹莓品種歐洲紅、美國22、金秋、黑樹莓葉片中黃酮類化合物對·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·4種自由基的清除情況分別見圖5-a、圖5-b、圖5-c、圖5-d。從圖5中可見，4個樹莓品種葉片中黃酮類化合物對·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·的清除能力均表現(xiàn)為6月末最強；品種中以歐洲紅最高，其對4種自由基：·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·的清除率分別為74.31%、53.17%、82.88%和91.84%。

4個樹莓品種果實中黃酮類化合物對·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·4種自由基的清除情況分別見圖6-a、圖6-b、圖6-c、圖6-d。從圖6中可見，4個樹莓品種果實中黃酮類化合物對·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·的清除能力均表現(xiàn)為青果遠(yuǎn)大于熟果；品種中以金秋最高，其對4種自由基的清除能力最強，金秋對上述4種自由基的清除率分別為68.88%、63.88%、92.45%、96.39%。

選取4個樹莓品種在6月末采集的葉片（此階段黃酮類化合物含量最高），與其青果對4種自由基的清除能力進(jìn)行比較，結(jié)果見圖7。從圖7可見，除了歐洲紅對·OH的清除能力表現(xiàn)為葉片大于青果（圖7-a）外，其余3個品種對4種自由基（圖7-b、圖7-c、圖7-d）、歐洲紅對其他3種自由基的清除能力（圖7-a）均表現(xiàn)為青果強于葉片。

3 小結(jié)與討論

試驗測定了4個果實顏色不同的樹莓品種歐洲紅、美國22、金秋、黑樹莓的結(jié)果枝、根蘗枝葉片和青果、熟果中黃酮類化合物在不同生長期含量的變化，結(jié)果表明，4個品種葉片黃酮類化合物含量均在6月末出現(xiàn)最大值，此階段和5月相比，葉片發(fā)育成熟，顏色較深，為具有旺盛光合作用的功能葉片[13]。而在7月末，夏果型樹莓歐洲紅和美國22已進(jìn)入果實成熟期，結(jié)果枝生長開始衰弱（夏果型樹莓的生長特點），葉片中的黃酮類化合物含量也表現(xiàn)為降低；但美國22一直到8月末降低的幅度都不大，可能是由于美國22是一個生長勢極強的品種，其結(jié)果枝上的葉片綠色期保持時間很長的緣故[14]。歐洲紅和美國22結(jié)果枝葉片的黃酮類化合物含量均高于根蘗苗，這可能是由于2個品種的結(jié)果枝為二年生枝條，含有較多的貯藏營養(yǎng)，因而葉片發(fā)育的成熟度更高一些。金秋和黑樹莓在萌芽前進(jìn)行了平茬處理，因此其結(jié)果枝皆為一年生枝條，其黃酮類化合物含量低于歐洲紅和美國22結(jié)果枝的含量，而和歐洲紅和美國22根蘗苗的含量相當(dāng)。試驗結(jié)果表明，樹莓葉片中的黃酮類化合物含量及抗氧化性與品種、植株的生長特性、枝條類型和葉片的發(fā)育時期有著很大的關(guān)系，因此在實際應(yīng)用中，若想獲得高含量黃酮類化合物的樹莓材料，則應(yīng)選擇黃酮類化合物含量高的品種，并在含量高的枝條上于適宜的生長期采摘。

樹莓葉片、果實中黃酮類化合物提取物對4種自由基（·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·）均表現(xiàn)出一定的清除能力，且其清除能力和黃酮類化合物的含量有關(guān)，黃酮類化合物含量越高，清除能力則越強[15]。在4種自由基中，樹莓材料對DPPH·清除能力最強，如歐洲紅在6月份采集的葉片對DPPH·的清除能力可達(dá)到91.84%，說明樹莓中的黃酮類化合物具有極強的抗氧化能力。而對葉片、果實中的黃酮類化合物清除自由基能力的分析結(jié)果表明，雖然果實中的黃酮類化合物含量低于葉片中的含量[16]，但其抗氧化能力卻強于葉片，這可能是由于葉片與果實中的黃酮類化合物種類不同，因此表現(xiàn)出的生理活性也不同造成的。

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