林曉林等

摘要：通過生物信息學方法對水稻（Oryza sativa L.）蠟質(zhì)合成相關基因OsCER4啟動子序列和表達特性進行了分析；通過構(gòu)建OsCER4啟動子驅(qū)動的GUS融合表達載體，分析了OsCER4基因的時空表達；并分別以200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA和1.0% H2O2處理水稻幼苗，通過半定量RT-PCR分析逆境脅迫下OsCER4的表達模式。啟動子序列分析表明，OsCER4啟動子中包括大量根、莖、葉肉等特異表達位點以及與干旱、冷、鹽等多種逆境脅迫相關的調(diào)控序列。表達特征分析表明，OsCER4基因在愈傷組織、根、莖、葉中均有表達，在穎殼和子房中也有表達。NaCl和PEG等逆境脅迫下，OsCER4基因表達量在不同處理時間有所增加，H2O2脅迫下，OsCER4基因表達量有所下降。

關鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）；OsCER4基因；啟動子；表達；逆境

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4607-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.056

植物在生長發(fā)育過程中，常常會受到干旱、鹽漬、低溫、病蟲害等非生物和生物脅迫因素的影響，其中，水分脅迫是環(huán)境脅迫中最普遍的逆境因子。干旱脅迫嚴重影響植物生長，增強植物抗旱性已成為植物育種的重要研究方向。在干旱逆境脅迫條件下，植物不僅可以通過細胞內(nèi)的生理生化變化提高對干旱脅迫的耐性，如產(chǎn)生滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸以及增加抗氧化能力等。同時，植物還可以通過誘導干旱脅迫應答基因表達，產(chǎn)生大量特異蛋白，協(xié)同調(diào)節(jié)植物生理生化而適應外部逆境，提高對干旱的抗性。因此，剖析相關基因在植物逆境脅迫應答中的作用已成為植物分子生物學和作物抗旱研究的熱點。

所有植物的地上部分表皮細胞外都覆蓋著角質(zhì)層，角質(zhì)層由最外層的上表皮蠟質(zhì)層和角質(zhì)膜層組成，其主要功能是防止植物水分損失[1]，同時也是抵御外源物質(zhì)滲入和微生物入侵的有效屏障[2]。多個與蠟質(zhì)相關的基因已經(jīng)在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa L.）等植物中被相繼發(fā)現(xiàn)[3-10]，烷類合成相關的蠟質(zhì)基因CER1在干旱脅迫條件下表達量顯著增加[5]，而過表達CER1基因提高了植株抗逆性[6]。擬南芥角質(zhì)層蠟質(zhì)和角質(zhì)合成的必需基因LACS1和LACS2發(fā)生突變增加了植株對干旱的敏感性[7]；水稻角質(zhì)層蠟質(zhì)合成相關基因OsGL1-1和OsGL1-2（又命名為WSL2）的突變導致植株葉表面蠟質(zhì)明顯減少，增加了植株干旱敏感性，而過表達OsGL1-1基因提高了植株對干旱的抗性[8-10]。過表達苜蓿中克隆的轉(zhuǎn)錄基因WXP1能增加表皮蠟質(zhì)的積累，減少水分的喪失，增加抗旱能力[11]，轉(zhuǎn)WXP1基因的擬南芥耐旱性同樣增加[12]。OsCER4基因與擬南芥CER1基因，水稻OsGL1-1基因和OsGL1-2基因高度同源，屬于脂肪醛脫羧酶（Fatty aldehyde decarbonylase）基因家族成員[13，14]。OsCER4基因（OsGL1-6）主要影響葉表面蠟質(zhì)的合成，OsCER4基因（OsGL1-6）表達量的下降導致葉表面蠟質(zhì)減少，干旱敏感性增加[15]。本研究通過生物信息學方法對水稻蠟質(zhì)合成相關基因OsCER4（OsGL1-6）啟動子序列和表達特性進行分析，同時，對逆境脅迫下OsCER4基因（OsGL1-6）的表達模式進行研究，為闡明OsCER4（OsGL1-6）基因在逆境脅迫下的分子作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 水稻（Oryza sativa L.）品種中花11，由華南農(nóng)業(yè)大學遺傳工程實驗室提供。

1.1.2 載體與菌株 pCAMBIA1300G，以pCAMBIA1300與pBI221聯(lián)合改建而成，在pCAMBIA1300的多克隆位點上插入了一段CaMV 35S啟動子-GUS-終止子的序列，由華南農(nóng)業(yè)大學遺傳工程實驗室提供；大腸桿菌菌株為DH10B；農(nóng)桿菌菌株為EHA105，由華南農(nóng)業(yè)大學遺傳工程實驗室保存。

1.1.3 試劑 RNA抽提試劑盒TRIzol 購自 Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄酶（AMV RTase）、RNase inhibitor、Taq DNA聚合酶和dNTP等購自寶生物工程（大連）有限公司；氯仿、無水乙醇等為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 引物 OsCER4啟動子擴增引物為OsCER4Gpr（5′-AAAAGGATCCTAGAGGCCATGATAGCTAGC-3′）和OsCER4Gpf （5′-AAAAAAG

CTTGGTTTGGAGATACAATCTGTG-3′）；OsActI擴增引物為OsActI-R（5′-TCTGGGTCATCTTCTCACGA-3′）和OsActI-F（5′-CGTCTGCGATAATGGAACTG-3′）；OsCER4擴增引物為OsCER4-R（5′-TCGTCGTATGGCCGGAATC-3′）和OsCER4-F（5′-GTCATGCAGTTACAGCAGCA-3′）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 應用PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）對啟動子順式調(diào)控元件進行預測；應用RIFGP（http：//plantbiol.genetics.ac.cn/rice-Affy）對OsCER4表達的組織器官特異性進行分析。

1.2.2 OsCER4啟動子表達分析 以OsCER4Gpf、OsCER4Gpr為引物，以中花11基因組DNA為模板擴增蠟質(zhì)合成相關基因OsCER4啟動子片段，PCR擴增反應程序： 94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，共7個循環(huán)；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，共28個循環(huán)；68 ℃延伸10 min。以OsCER4啟動子片段替代載體pCAMBIA 1 300中的CaMV35S啟動子，重新組裝的載體采用農(nóng)桿菌介導方法轉(zhuǎn)入水稻中花11[16]。分別取轉(zhuǎn)化水稻的愈傷組織、根、莖、葉、穗子等材料放于固定液（50 mmol/L磷酸緩沖液、1% 甲醛、0.5% Triton-100、pH 7.0）中，抽真空10 min，固定45 min；棄去固定液，加入適量洗液[50 mmol/L 磷酸緩沖液、0.5% Triton-100、1 mmol/L K3Fe（CN）6，1 mmol/L K4Fe（CN）6·3H2O、pH 7.0]，抽真空5 min，洗3次；棄去洗液，加入染色液[1 mmol/L磷酸緩沖液、0.5% Triton-100、0.25 mg/mL X-Gluc、1 mmol/L K3Fe（CN）6、1 mmol/L K4Fe（CN）6·3H2O、pH 7.0]，抽真空15 min，置于37 ℃反應過夜；樣品以70%乙醇進行洗滌和保存，并在解剖鏡下進行觀察拍照。

1.2.3 逆境處理 參照Li等[17]方法進行，PEG、H2O2和NaCl的濃度分別為12%（M/V），1.0%（V/V），200 mmol/L。

1.2.4 RT-PCR分析 總RNA抽提參照李玲等[18]方法，逆轉(zhuǎn)錄反應參照Cristina等[19]方法。以OsActI為內(nèi)參基因，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以OsCER4-R、OsCER4-F為引物進行PCR擴增，分析蠟質(zhì)合成相關基因OsCER4的表達情況。PCR擴增反應體系：cDNA 1 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）0.25 μL、上游引物（10 μmol/L）1 μL、下游引物（10 μmol/L）1 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、ddH2O 19.05 μL。PCR擴增反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsCER4基因啟動子的反式作用元件分析

應用植物啟動子及其反式元件分析在線數(shù)據(jù)庫PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html）對OsCER4啟動子順式作用元件進行了預測，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，OsCER4啟動子存在典型的TATA-box和啟動子的基本元件CAAT-box以及大量的組織特異表達核苷酸位點：29個葉肉特異表達的CACTFTPPCA1位點，22個莖特異表達的位點DOFCOREZM和CCA1ATLHCB1，38個根特異表達位點ROOTMOTIFTAPOX1，RHERPATEXPA7，RYREPEATBNNAPA和RAV1AAT；4個花器發(fā)育相關元件MYBPLANT和NTBBF1ARROLB。OsCER4啟動子也包括大量的與逆境相關的順式作用元件：早期應答脫水脅迫和ABA應答有關的順式作用元件ACGTABREMOTIFA2OSEM、ABRELATERD1、

ACGTATERD1、ANAERO1CONSENSUS、MYB1AT、MYBCORE、DPBFCOREDCDC3、CATATGGMSAUR、GADOWNAT、MYB1AT、MYCATRD22、MYCATERD1和WRKY71OS以及響應高鹽、冷、傷害、病原菌等生物和非生物脅迫的順式元件GT1GMSCAM4、MYCCONSENSUSAT、BIHD1OS、MYBPZM、RAV1AA

T、OSE2ROOTNODULE、WBBOXPCWRKY1、MYBST

1、ELRECOREPCRP1和WBOXNTERF3等；還有響應Ca2+信號、氧化脅迫以及銅離子脅迫相關的順式作用元件CURECORECR和ABRERATCAL。同時，還存在外源激素信號分子生長素、細胞分裂素、水楊酸相關順式作用元件SURECOREATSULTR11、ARR1AT、CPBCSPOR、WBOXATNPR1和ASF1MOT

IFCAMV等。除了脅迫相關順式作用元件，還發(fā)現(xiàn)與儲藏蛋白質(zhì)表達相關的調(diào)控元件2SSEEDPROTBANAPA和SEF4MOTIFGM7S；光誘導順式作用元件GATABOX、REALPHALGLHCB21和IBOXCORE/SORLIP1AT以及糖應答元件CGACGOSAMY3、WBOXHVISO1、YRIMIDINEBOXOSRAMY1A、TATC

CAYMOTIFOSRAMY3D和MYBGAHV等。通過啟動子順式元件網(wǎng)站的分析預測，水稻蠟質(zhì)合成相關基因OsCER4啟動子具有葉、根、莖等組織特異表達的特性，且存在多個響應生物和非生物逆境脅迫的元件。

2.2 OsCER4基因的表達分析

通過水稻基因組芯片表達數(shù)據(jù)庫（http：//plantbiol.genetics.ac.cn/rice-Affy）分析表明，OsCER4基因主要在幼苗葉、幼苗、子房和胚中表達，OsCER4基因可能在葉或種子發(fā)育中起作用（表2）。

2.3 OsCER4啟動子的表達分析

從中花11基因組中用引物OsCER4Gpr和OsCER4Gpf擴增OsCER4基因的啟動子OsCER4P。結(jié)果表明，獲得與預期大小一致的1 946 bp特異片段（圖1a）。用Hind Ⅲ和BamHⅠ雙酶切將OsCER4P啟動子片段克隆到pCAMBIA1300G載體中，用OsCER4基因的啟動子CER4P替代載體中的35S啟動子，然后抽提質(zhì)粒DNA進行酶切鑒定，結(jié)果如圖1b所示。將質(zhì)粒DNA酶切鑒定的菌液送至Invitrogen公司測序，測序正確的菌株抽取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。同時，本研究通過對農(nóng)桿菌的GUS染色來鑒定啟動子啟動GUS活性表達的能力以及進一步確認農(nóng)桿菌的陽性克隆。結(jié)果（圖1c）表明，啟動子具有啟動GUS活性表達的能力。通過農(nóng)桿菌介導法將OsCER4P：：GUS載體轉(zhuǎn)化水稻，轉(zhuǎn)化植株經(jīng)陽性植株鑒定之后，取其愈傷組織、根、莖、葉及小穗進行GUS染色，通過GUS組織化學染色方法來分析OsCER4基因啟動子表達的特異性。GUS染色分析表明，在愈傷組織、根、莖、葉中均能檢測到GUS活性（圖2）。在穎殼和子房中也有GUS活性表達，說明OsCER4的表達有組織特異性，可能與營養(yǎng)器官和種子的發(fā)育有關。

2.4 逆境脅迫下OsCER4的表達分析

為考察水稻蠟質(zhì)合成相關基因OsCER4對逆境的響應，本研究采用半定量RT-PCR的方法分析不同逆境處理下幼苗中OsCER4表達變化。結(jié)果（圖3）表明，NaCl處理下對OsCER4而言，在處理6 h之內(nèi)，其表達量下降，當處理時間達12 h時，表達量有所增加；PEG處理下，OsCER4表達量在處理30 min 后開始有所增加，并維持在較高水平，36 h時略有下降；H2O2處理下，OsCER4表達量在處理30 min 時變化不明顯，3 h時表達量開始下降。

3 小結(jié)與討論

植物基因啟動子控制著基因在特定的組織、特定的發(fā)育階段以及一定的環(huán)境條件下表達?；蛩憩F(xiàn)的時空特異性受到該基因啟動子區(qū)域內(nèi)各種順式作用元件與不同反式作用因子之間相互作用的協(xié)調(diào)控制。啟動子序列分析表明，OsCER4基因啟動子具有啟動子常有的相應調(diào)控元件以及下游組織特異性表達必需的核苷酸序列，包括TATA-box、CAAT-box等。啟動子還含有大量的組織特異表達順式作用元件：葉肉、莖、根、花器發(fā)育（MYBPLANT）以及微管組織發(fā)育（NTBBF1ARROLB）相關的特異順式表達元件，說明OsCER4基因可能與營養(yǎng)器官和微管組織以及種子的發(fā)育有關。通過水稻基因組芯片表達數(shù)據(jù)庫分析表明，OsCER4基因在幼苗、幼葉、子房和胚中表達量較高。而OsCER4啟動子驅(qū)動的GUS融合表達分析表明，OsCER4基因啟動子在根、莖、葉、葉枕、穎殼、子房等均有表達活性，在花藥中幾乎沒有表達活性，進一步說明OsCER4基因可能與營養(yǎng)器官和種子的發(fā)育有關。在對OsCER4基因（OsGL1-6）的前期研究中發(fā)現(xiàn)，OsCER4基因表達部位集中于維管束區(qū)域[15]，這一結(jié)果與本研究對啟動子區(qū)域的組織特異表達順式作用元件分析一致。說明OsCER4基因啟動子序列上一系列的順式元件決定了其組織器官的表達。

植物組織特異表達的啟動子中存在著不同的結(jié)構(gòu)域，通過這些結(jié)構(gòu)域的協(xié)同作用調(diào)節(jié)著啟動子不同的表達模式。OsCER4基因啟動子序列中還有大量干旱、高鹽、病原菌、冷等逆境脅迫應答相關順式作用元件，說明OsCER4基因啟動子調(diào)控的下游基因與植物逆境應答反應相關。本研究應用RT-PCR技術研究該基因在PEG、高鹽和H2O2等處理下的表達模式，結(jié)果表明，在高鹽和干旱處理條件下，OsCER4基因表達量均有所上調(diào)。植物表皮蠟質(zhì)層在植物生長發(fā)育、適應外界環(huán)境方面具有重要作用，植物表皮蠟質(zhì)層的增加常常受環(huán)境逆境的誘導。玉米、擬南芥等植物蠟質(zhì)合成中的關鍵基因在mRNA水平上的表達受干旱、鹽逆境處理調(diào)節(jié)[20]。擬南芥在150 mmol/L NaCl處理下葉蠟質(zhì)總量增加[5]。水稻幼苗在NaCl、H2O2、ABA等逆境脅迫下，OsGL1-5基因表達均受到誘導[20]。逆境處理誘導蠟質(zhì)合成相關基因的表達以及增加蠟質(zhì)的積累可能是植物適應環(huán)境的一種機制。蠟質(zhì)合成相關基因在不同逆境處理下誘導表達的情況不一樣，本試驗發(fā)現(xiàn)H2O2處理下，OsCER4基因表達量下降，而在分析OsGL1-5基因的逆境響應時發(fā)現(xiàn)其在H2O2處理下的表達量增加[21]。高國賦等[22]的研究也發(fā)現(xiàn)不同蠟質(zhì)合成相關基因?qū)Σ煌{迫響應存在差異，前期研究高溫和低溫對蠟質(zhì)基因表達的影響時也有同樣發(fā)現(xiàn)[16]。

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