陳沐 劉學(xué) 余東升 王成 王偉財(cái) 黃洪章

1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院口腔科，深圳 518052；2.中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，中山大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所，廣州 510055

先天性唇腭裂是一類常見的口腔頜面部缺陷，占所有先天性畸形的65%左右。目前我國(guó)非綜合征性唇腭裂的發(fā)病率為0.762‰，其中非綜合征性腭裂的發(fā)病率為0.2‰[1]；中國(guó)出生缺陷監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，腭裂年度發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[2]；因此腭裂是目前出生缺陷研究中的焦點(diǎn)問題之一[3-4]。已有研究[5]表明，妊娠期攝入致畸物可能導(dǎo)致新生兒腭裂的發(fā)生。在致畸物的研究中，維生素A族與唇腭裂發(fā)病的關(guān)系一直受到唇腭裂病因研究學(xué)者的高度關(guān)注[6]。全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，atRA）是維生素A在體內(nèi)的代謝中間產(chǎn)物及發(fā)揮功能的主要形式，參與調(diào)節(jié)早期胚胎細(xì)胞的定向分化，在胚胎發(fā)生、發(fā)育中起重要作用[7]。在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中，過多攝入維甲酸可導(dǎo)致神經(jīng)管、心臟和顏面部等多種畸形的發(fā)生，形成唇腭裂、面中部發(fā)育不良、顱中縫早閉等一系列的頜面部骨骼發(fā)育畸形，但其作用機(jī)制目前仍未十分明確[8-9]。

有學(xué)者[10-11]認(rèn)為，上頜骨的生長(zhǎng)發(fā)育障礙是腭裂畸形本身內(nèi)在的發(fā)育缺陷所致。根據(jù)國(guó)內(nèi)外的研究[12-15]可以發(fā)現(xiàn)，腭裂可因胚胎發(fā)育時(shí)期的胚胎細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞的分化、移動(dòng)、增殖受到干擾而引起；一些致畸劑通過阻斷某些基因的表達(dá)或干擾某些物質(zhì)（如表皮生長(zhǎng)因子受體、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3等）的合成而影響胚胎細(xì)胞的分化移動(dòng)。當(dāng)裂隙形成后，這些內(nèi)源性因素就成為影響上頜骨發(fā)育的主要原因。研究[16]指出，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號(hào)通路在唇及腭部的發(fā)育中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，然而BMP信號(hào)通路在atRA誘導(dǎo)過程中的表達(dá)模式及其對(duì)小鼠腭突生長(zhǎng)發(fā)育影響的調(diào)控作用目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用孕鼠妊娠第10天時(shí)atRA灌胃的方法，用免疫組織化學(xué)及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)BMP信號(hào)通路關(guān)鍵因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體（bone morphogenetic protein receptor，BMPR）2的時(shí)空表達(dá)，為后期研究維甲酸對(duì)腭部間充質(zhì)細(xì)胞成骨分化進(jìn)程的影響建立理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

無特定病原體（spece fi c pathogen free，SPF）級(jí)6～10周齡未生育C57BL/6N小鼠（購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；atRA（Sigma-Aldrich公司，美國(guó)，批號(hào)R2625）；BMPR2抗體（Santa Cruz公司，美國(guó)）；SP免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將C57BL/6N小鼠于上午8時(shí)按雌雄比例1∶1合籠，2 h后檢查陰栓，查見陰栓日定為妊娠（gestation day，GD）0 d（GD0）。將atRA溶解于玉米油中配制成10 g·L-1溶液，以純玉米油作為對(duì)照。在GD10隨機(jī)將妊娠母鼠分為兩組，實(shí)驗(yàn)組按照100 mg·kg-1劑量給予atRA灌胃1次，對(duì)照組給予相同劑量的玉米油灌胃。

1.3 蘇木精-伊紅（haematoxylin-eosin，HE）染色

兩組動(dòng)物分別在GD15、GD17時(shí)隨機(jī)選取3只，以頸椎脫位法處死，剖腹取出所有胚胎。每只孕鼠的胚胎仔鼠中隨機(jī)選取5只，在體視顯微鏡下用顯微外科器械從口裂至耳屏前水平切開，以顯微鑷去除下頜、舌體及后腦組織，充分暴露胎鼠腭突。取材組織固定、包埋并進(jìn)行HE染色。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

免疫組織化學(xué)染色方法和操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。切片脫蠟至水，封閉通透液浸潤(rùn)，檸檬酸修復(fù)抗原，5%血清封閉非特異性蛋白，一抗（1∶100）濕盒孵育4 ℃過夜；次日復(fù)溫，PBS洗后加入稀釋的二抗烤片；PBS洗后滴加DAB溶液顯色，蘇木素染液復(fù)染，鹽酸乙醇藍(lán)化，中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察。在高倍鏡下隨機(jī)選取小鼠胚胎腭突部5個(gè)視野觀察100個(gè)組織細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞所占的百分比為陽性指數(shù)，取其均值計(jì)為BMPR2的表達(dá)強(qiáng)度。

1.5 RT-PCR檢測(cè)

在GD15和GD17時(shí)按照步驟1.3的方法取兩組孕鼠的胚胎，分離胚胎腭突并取材，冷PBS清洗，取50～100 mg組織塊，用液氮在研缽中研磨成粉末。參照Trizol試劑說明書提取胚胎腭突內(nèi)總RNA。按照Thermo ScriptRTSystem試劑盒說明書要求進(jìn)行RTPCR反應(yīng)，引物序列如表1所示。RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果采用凝膠成像系統(tǒng)照相，測(cè)定每一條帶的灰度值。目的基因mRNA的表達(dá)以目的基因灰度值/內(nèi)參β-actin灰度值表示。將目的基因mNRA表達(dá)比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)輸入SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)樣本檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

表1 RT-PCR引物Tab 1 Primers of RT-PCR

2 結(jié)果

HE染色觀察胚胎腭突的發(fā)育情況見圖1，免疫組織化學(xué)檢測(cè)胚胎腭部BMPR2的表達(dá)情況見圖2。通過HE染色可見，GD15時(shí)，對(duì)照組兩側(cè)腭突在中線處已經(jīng)接觸融合，腭中縫上皮消失，兩側(cè)胚胎腭間充質(zhì)組織相互交雜，間充質(zhì)細(xì)胞核呈梭形，向腭突中心部位遷移生長(zhǎng)，中線處有大量細(xì)胞聚集，已經(jīng)出現(xiàn)細(xì)胞聚集區(qū)（圖1A）；實(shí)驗(yàn)組兩側(cè)腭突不能在中線處接觸，間充質(zhì)組織無法相互貫通，無明顯細(xì)胞聚集區(qū)（圖1B）。對(duì)照組間充質(zhì)細(xì)胞分布出現(xiàn)區(qū)域差異，腭突生長(zhǎng)迅速的部位即腭突突部細(xì)胞密集，根部則細(xì)胞稀疏；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分布呈現(xiàn)與對(duì)照組相似的規(guī)律，但實(shí)驗(yàn)組腭突突部的細(xì)胞密集程度較對(duì)照組差。

圖1 小鼠腭部發(fā)育的病理學(xué)觀察 HE × 100Fig 1 The morphology observation of mice embryonic palates HE × 100

圖2 小鼠腭部BMPR2的免疫組織化學(xué)染色 SP × 100Fig 2 Immunohistochemical stain of BMPR2 of mouse embryonic palates SP × 100

GD17時(shí)，對(duì)照組雙側(cè)腭突完全融合，間充質(zhì)細(xì)胞凝集區(qū)進(jìn)一步擴(kuò)大，腭胚突間充質(zhì)細(xì)胞開始向成骨細(xì)胞分化，呈圓形，核仁大，出現(xiàn)多核細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)嗜蘇木精染色，在中心區(qū)出現(xiàn)骨組織，骨化中心開始形成（圖1C）；實(shí)驗(yàn)組腭突沒有在中線處融合，形成體積較小的畸形腭突，兩側(cè)腭突間充質(zhì)內(nèi)可見成骨中心區(qū)，但其范圍明顯小于對(duì)照組（圖1D）。

免疫組織化學(xué)染色可見，GD15時(shí)，BMPR2在對(duì)照組胚胎腭部有高水平表達(dá)，在腭突上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞中都有陽性反應(yīng)顆粒，陽性指數(shù)為75%～100%；實(shí)驗(yàn)組BMPR2陽性指數(shù)低于25%，表達(dá)強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組，主要分布在腭突間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖2A、B）。GD17時(shí)，對(duì)照組BMPR2染色強(qiáng)度較GD15時(shí)期變化不大，陽性指數(shù)達(dá)到50%～75%，陽性顆粒分布區(qū)域較廣，在細(xì)胞凝集區(qū)成骨中心周圍更為明顯；而實(shí)驗(yàn)組的陽性指數(shù)約為25%，陽性染色主要集中在細(xì)胞凝集區(qū)，非凝集區(qū)的細(xì)胞陽性顆粒少（圖2C、D）。

RT-PCR檢測(cè)胚胎腭部Bmpr2 mRNA的表達(dá)情況見圖3。在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均可檢測(cè)到Bmpr2 mRNA的表達(dá)，也可見到β-actin內(nèi)參照的表達(dá)（圖3上）。分析Bmpr2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，對(duì)照組GD15時(shí)的表達(dá)水平明顯高于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05），GD17時(shí)的表達(dá)水平與GD15時(shí)差異不大，但仍明顯高于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）（圖3下），提示atRA可能下調(diào)了腭突Bmpr2 mRNA的表達(dá)水平。

圖3 小鼠腭部Bmpr2 mRNA表達(dá)的RT-PCR測(cè)定Fig 3 Bmpr2 mRNA expression of mouse embryonic palate by RTPCR

3 討論

胚胎腭的發(fā)生發(fā)育期是致畸藥物作用的敏感時(shí)期[17]。小鼠胚胎7～12 d為腭器官發(fā)生期，胚胎12～15 d為腭發(fā)育形成期[18]。本研究在孕鼠GD10時(shí)使用atRA灌胃，實(shí)驗(yàn)組腭突發(fā)育明顯滯后，雙側(cè)腭突未能及時(shí)接觸融合。有研究[19-20]認(rèn)為，維甲酸的作用使腭突間充質(zhì)細(xì)胞增殖受到抑制，分布異常，雙側(cè)腭突無法正常接觸融合導(dǎo)致腭裂畸形。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)[21-23]中發(fā)現(xiàn)，在小鼠GD10時(shí)采用100 mg·kg-1的atRA灌胃，誘導(dǎo)腭裂發(fā)生的比例為67%～100%，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，atRA誘導(dǎo)成功的絕大部分標(biāo)本的腭突呈水平生長(zhǎng)，但兩側(cè)腭突不能在中線處接觸并及時(shí)融合，間充質(zhì)組織無法相互貫通。本實(shí)驗(yàn)觀察到atRA誘導(dǎo)后胎鼠腭突間充質(zhì)組織的細(xì)胞凝集區(qū)形成相對(duì)滯后且變小，提示實(shí)驗(yàn)組小鼠胚胎腭部發(fā)育后期的成骨情況可能不如對(duì)照組，有可能導(dǎo)致腭部骨骼畸形的發(fā)生。有研究[24-25]發(fā)現(xiàn)，atRA能使細(xì)胞凝集區(qū)的細(xì)胞維持在低分化的間充質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)，阻止其向軟骨細(xì)胞分化，這種抑制軟骨分化的作用可能和atRA下調(diào)了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β/Smad信號(hào)通路有關(guān)。Lu等[26]通過原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在正常腭胚發(fā)育階段，BMP2、4、5在上皮和間充質(zhì)都有一定量的表達(dá)，其后隨著腭部發(fā)育逐漸消退，但在細(xì)胞凝集區(qū)內(nèi)依然有強(qiáng)表達(dá)；而atRA誘導(dǎo)的腭裂鼠模型中，Bmp2、4、5 mRNA表達(dá)水平較正常低，且細(xì)胞凝集區(qū)的出現(xiàn)時(shí)間延遲，腭突的形態(tài)萎縮變小，不能接觸融合而導(dǎo)致腭裂。Bandyopadhyay等[27]通過免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行半定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腭突發(fā)育期間BMP2、4、7的表達(dá)量持續(xù)上升，在凝聚區(qū)尤為明顯，較散在間質(zhì)區(qū)高出2～4倍，但維甲酸誘導(dǎo)的腭裂鼠中，BMP蛋白的表達(dá)量明顯減少。

BMP信號(hào)主要調(diào)控胚胎發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)等重要進(jìn)程，在骨骼發(fā)育中起關(guān)鍵作用[27]。有研究[26,28]指出，atRA使腭突間充質(zhì)細(xì)胞區(qū)的Bmp2、4、5、7 mRNA明顯下降，提示妊娠期孕鼠維甲酸灌胃可能影響腭突區(qū)BMP信號(hào)的表達(dá)。本課題組在前期研究[21]中也發(fā)現(xiàn)，BMPR1b的表達(dá)與腭突間充質(zhì)組織的生長(zhǎng)發(fā)育呈正相關(guān)，在GD10灌胃維甲酸后，GD13—GD17胎鼠腭間充質(zhì)中Bmpr1b mRNA以及蛋白的表達(dá)水平均下調(diào)。BMPR2是BMP的細(xì)胞膜受體，是BMPR1的激活劑，二者結(jié)合在一起形成受體復(fù)合物，激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，如Smad蛋白等，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，維持正常細(xì)胞功能活動(dòng)[29]。小鼠神經(jīng)嵴缺乏BMP信號(hào)將產(chǎn)生帶有多種顱頜面部骨骼缺陷的表型，在神經(jīng)嵴細(xì)胞中敲除BMPR1a會(huì)誘使小鼠發(fā)生腭裂、下頜萎縮等顱面部畸形[30]。BMPR1a突變還將導(dǎo)致小鼠胚胎流產(chǎn)，同時(shí)流產(chǎn)胚胎無法形成中胚層組織[31]。進(jìn)一步研究[32]指出，BMPR1b對(duì)骨骼形成也非常重要，在顱面部的骨骼發(fā)育區(qū)和成熟區(qū)都有高度表達(dá)，轉(zhuǎn)基因鼠實(shí)驗(yàn)證明缺乏BMPR1b的小鼠將發(fā)生顱骨骨化延遲。近年來，在BMPR2作用機(jī)制及其與遺傳疾病、骨的形成與再生、哺乳動(dòng)物的發(fā)育等關(guān)系的研究中取得了一些重要的進(jìn)展。在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育早期，BMPR2調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)通路的功能穩(wěn)定，維持妊娠過程正常[33]。Bmpr2基因突變后，BMPR2蛋白表達(dá)下降，導(dǎo)致BMP信號(hào)通路功能受損[34]。盡管已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但目前對(duì)腭部BMPR2的相關(guān)研究仍較少，尚不明確它在維甲酸誘導(dǎo)腭突中的表達(dá)情況。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)[21]中觀察到，胎鼠腭間充質(zhì)細(xì)胞在GD15—GD17出現(xiàn)較為明顯的細(xì)胞凝集區(qū)并逐步分化為成骨細(xì)胞，在中心區(qū)形成骨組織，在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)選擇GD15和GD17作為時(shí)間點(diǎn)，通過免疫組織化學(xué)和RT-PCR方法檢測(cè)BMPR2的表達(dá)是否受到atRA的影響，為下一步研究維甲酸對(duì)腭部成骨分化的影響提供基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)中，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，正常腭部GD15的BMPR2處于高水平表達(dá)狀態(tài)，但在atRA誘導(dǎo)的腭突中，BMPR2的表達(dá)量下調(diào)。這種情況在GD17小鼠腭部進(jìn)入分化期時(shí)依然持續(xù)。RT-PCR結(jié)果也證實(shí)Bmpr2 mRNA在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量明顯下調(diào)，提示atRA處理將下調(diào)腭突Bmpr2的表達(dá)量。Beppu等[35]通過基因打靶的方式培育了Bmpr2突變小鼠，發(fā)現(xiàn)在小鼠的早期發(fā)育中，Bmpr2對(duì)傳遞BMP信號(hào)至關(guān)重要，是外胚層分化和中胚層誘導(dǎo)所必需的關(guān)鍵因子。通過牙周組織再生研究[36]發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素-1β和生物機(jī)械力會(huì)通過下調(diào)BMPR2來抵消釉基質(zhì)蛋白衍生物（enamel matrix derivative，EMD）誘導(dǎo)BMP2合成的作用。BMPR2無論在膜內(nèi)成骨還是軟骨內(nèi)成骨中都呈現(xiàn)出活躍表達(dá)，BMP及其受體系統(tǒng)能誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞的分化，破骨細(xì)胞的再吸收，對(duì)骨的形成（包括異位成骨）與再生起重要作用。在BMP2促進(jìn)小鼠異位成骨過程中，未分化間充質(zhì)細(xì)胞的BMPR2表達(dá)水平在早期即顯著上調(diào)[37]。在早期研究[26]中已發(fā)現(xiàn)維甲酸能導(dǎo)致腭突間充質(zhì)細(xì)胞凝集區(qū)的發(fā)生延遲并減弱未分化細(xì)胞向成骨方向分化，因此筆者推測(cè)atRA通過下調(diào)BMPR2表達(dá)水平影響B(tài)MP及其受體信號(hào)通路，從而使細(xì)胞凝集區(qū)發(fā)生延遲，腭突發(fā)育不良，并影響骨化中心的形成，甚至?xí)陔癫堪l(fā)育后期產(chǎn)生明顯的骨骼畸形。

BMP信號(hào)通路參與了體內(nèi)眾多重要的生命活動(dòng)過程，尤其是間充質(zhì)細(xì)胞的成骨分化和骨骼形成，BMPR2作為該通路中的關(guān)鍵受體蛋白，其結(jié)構(gòu)與含量的變化將會(huì)不同程度地影響該通路的正常運(yùn)行。本實(shí)驗(yàn)通過建立atRA誘導(dǎo)的小鼠腭裂模型來探索在腭部的BMP信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在atRA誘導(dǎo)下，腭突發(fā)育滯后，無法融合，細(xì)胞凝集區(qū)出現(xiàn)延遲且變小，同時(shí)Bmpr2 mRNA表達(dá)水平下調(diào)，BMPR2陽性率降低，提示維甲酸可能通過胚胎期腭突的BMP及其受體信號(hào)通路來影響腭部發(fā)育，尤其是腭部間充質(zhì)細(xì)胞的成骨分化進(jìn)程，對(duì)于闡明其正常的生理功能和異常的病理機(jī)制具有重要意義。目前維甲酸影響胚胎頜面部BMP信號(hào)造成骨骼異常的研究尚處于起步階段，其BMP信號(hào)和成骨分化進(jìn)程的變化模式還有待深入研究。

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