袁雯雯 王曉茜 張杰華 周聞捷 馮云 陳嬌 張平

口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫(yī)院（四川大學(xué)），成都 610041

牙周病是一種全球流行的多種致病微生物引起的口腔疾病，可以影響到全世界90%的人口[1]。其中較為常見的慢性牙周炎是由位于齦下菌斑的革蘭陰性致病菌啟動和發(fā)展的，最終導(dǎo)致結(jié)締組織的附著喪失、牙槽骨的吸收及成人牙齒的喪失。此外，還與牙周病和一些威脅生命的系統(tǒng)性疾病的發(fā)生呈正相關(guān)，如動脈粥樣硬化以及糖尿病等[2-3]。

程序性死亡分子1（programmed death 1，PD-1）是B7基因家族的一員，是T細(xì)胞活化過程中的負(fù)性調(diào)節(jié)分子[4]。程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）是PD-1的配體，文獻(xiàn)[5]報道PD-L1誘導(dǎo)性表達(dá)于體內(nèi)多種細(xì)胞，包括抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cells，APCs）、γ-干擾素（in-terferon-γ，IFN-γ）誘導(dǎo)的人外周血單個核細(xì)胞、激活的樹突細(xì)胞等。還有文獻(xiàn)[6]稱PD-L1廣泛表達(dá)于各種腫瘤細(xì)胞表面，如乳腺癌、卵巢癌、口腔癌等。PD-1/PD-L1是一對重要的負(fù)性協(xié)同刺激分子[4]，PD-1與PD-L1結(jié)合后會抑制T細(xì)胞受體介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的分泌[5]，從而在免疫調(diào)控中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。PD-1/PD-Ls途徑對維持外周免疫耐受有重要作用。此外，PD-1/PD-Ls和T細(xì)胞介導(dǎo)的多種疾病相關(guān)，如自身免疫性疾病、腫瘤免疫等[7-8]。

PD-L1與慢性炎癥的關(guān)系目前還不清楚。本課題旨在探討慢性牙周炎組織細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)與牙周炎癥程度的相關(guān)性，為闡明慢性牙周炎免疫調(diào)控機(jī)制，建立慢性牙周炎的實驗診斷、臨床預(yù)防和治療新方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

兔抗人PD-L1抗體（Abcam公司，美國），Immobilon Western化學(xué)發(fā)光HRP底物（Millipore公司，美國），Trizol（Invitrogen公司，美國），TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本），QuantiTect-SYBR Green PCR試劑盒（Qiagen公司，美國），HRP山羊抗兔IgG抗體、山羊抗兔IgG免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）儀、快速轉(zhuǎn)印儀、熒光化學(xué)發(fā)光成像儀（BIO-RAD公司，美國），Varioskan Flash多功能讀數(shù)儀（Thermo公司，美國），ABI7300熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（ABI公司，美國）。

1.2 樣本收集

本實驗分為3組，分別為正常對照組、輕度牙周炎組和重度牙周炎組。納入標(biāo)準(zhǔn)如下。1）正常對照：探診牙齦基本無出血，探診深度<3 mm，無牙周袋，無附著喪失，X線片顯示牙槽骨無吸收。2）輕度牙周炎：探診有出血，牙周袋≤4 mm，附著喪失1～2 mm，X線片顯示牙槽骨吸收不超過根長的1/3，缺失牙不超過3顆。3）重度牙周炎：牙周袋>6 mm，附著喪失≥5 mm，X線片顯示牙槽骨吸收超過根長的1/2甚至達(dá)根長的2/3，多根牙有根分叉病變，牙多有松動，缺失牙不超過14顆。排除標(biāo)準(zhǔn)：有糖尿病、甲亢、心臟病、高血壓等全身系統(tǒng)疾病的患者。牙齦組織塊大小約為2 mm×2 mm×2 mm，所有樣本均取自四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙周科和口腔頜面外科門診。其中，正常牙齦4例（男性2例，女性2例），取自因正畸需要進(jìn)行開窗牽引術(shù)的患者。輕度牙周炎牙齦4例（男性2例，女性2例），取自牙齒縱折需拔除的患者（縱折不超過3 d，全口檢查符合輕度牙周炎確診標(biāo)準(zhǔn)并且未進(jìn)行牙周治療）。重度牙周炎牙齦4例（男性2例，女性2例），取自因牙松動需做翻瓣術(shù)的患者。正常牙齒牙周膜16例（男性8例，女性8例），取自因正畸需要拔除的前磨牙。輕度牙周炎牙周膜16例（男性8例，女性8例），取自殘根無法保留需拔除的牙齒。重度牙周炎牙周膜16例（男性8例，女性8例），取自因松動無法保留需拔除的牙齒。牙齦組織立即浸泡在4%多聚甲醛中4 ℃固定，牙周膜立即轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱備用。牙周組織樣本的收集經(jīng)過四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理部門的嚴(yán)格審查和批準(zhǔn)，并征得了患者或其家屬的同意。

1.3 熒光定量PCR

取-80 ℃凍存的50～100 mg各組牙周膜組織（各8例），冰上解凍，分別加入1 mL Trizol，用勻漿器勻漿處理，按照Trizol說明書提取總RNA。以提取的總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA第一鏈，以cDNA為模板，分別加入PD-L1引物（上游和下游引物序列分別為5’-GAACTACCTCTGGCACATCCTCC-3’和5’-TAAACGGAAGATGAATGTCAGTGC-3’）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物（上游和下游引物序列分別為5’-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3’和5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過溶解曲線反映擴(kuò)增的特異性。2-ΔΔCt方法計算組間的mRNA相對表達(dá)量（倍數(shù)）[9]。

1.4 免疫印跡（Western blot）檢測

根據(jù)凱基全蛋白提取試劑盒說明書提取各組牙周膜的全蛋白（各8例），-80 ℃凍存?zhèn)溆?。將蛋白樣品上樣加?0%的SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)分離蛋白質(zhì)。將電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fl uoride，PVDF）膜上（200 mA，7 min）。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別加入PD-L1抗體（1︰200）和GAPDH抗體（1︰1 000），4 ℃過夜，TBST洗滌3次，每次10 min。加入HRP山羊抗兔二抗（1︰5 000），37 ℃ 1 h，TBST洗滌3次，每次10 min。用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)采集圖像。

1.5 免疫組織化學(xué)方法

將各組牙齦組織放置于ASP-200S自動脫水機(jī)脫水，石蠟包埋，切片（4 μm），二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水；3%H2O2室溫15 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗2次；高壓鍋抗原修復(fù)，PBS洗3次；山羊血清封閉30 min；向不同組切片中分別加入PD-L1抗體（1︰40），陰性對照加入PBS，4 ℃濕盒過夜，PBS洗滌3次；加入HRP山羊抗兔二抗，37 ℃ 1 h，PBS洗3次；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，氨水返藍(lán)，脫水透明，封片，顯微鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

mRNA的平均相對表達(dá)量用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用GraphPad Prism 5行統(tǒng)計分析，根據(jù)資料類型用ANOVA檢驗，取P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組牙齒牙槽骨的吸收情況

對收集的牙齒的影像學(xué)資料進(jìn)行整理，牙槽骨吸收的高度用X線片中釉牙骨質(zhì)界到牙槽骨水平最低點的距離表示，正常對照組、輕度牙周炎組、重度牙周炎組牙槽骨的平均吸收高度分別為（0.09±0.03）、（1.71±0.04）、（7.26±0.10） mm。

2.2 總RNA的純度

采用多功能讀數(shù)儀測定吸光度，所有樣本RNA的OD260/OD280均為1.8～2.0，說明提取的總RNA純度較高。

2.3 各組患者牙周膜中PD-L1 mRNA的相對表達(dá)量

在不同組的牙周膜樣本中，PD-L1均有表達(dá)。正常對照組、輕度牙周炎組、重度牙周炎組PD-L1 mRNA的平均相對表達(dá)量分別為1.01±0.02、5.00±0.15、1.57±0.05。輕度牙周炎組牙周膜中PD-L1的表達(dá)量最高。輕度牙周炎組和重度牙周炎組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；重度牙周炎組和正常對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 Western blot結(jié)果

采用Western blot檢測不同組PD-L1的表達(dá)，結(jié)果表明3組牙周膜組織中均有PD-L1表達(dá)（圖1）。正常對照組、輕度牙周炎組、重度牙周炎組中PD-L1表達(dá)的平均灰度值分別為0.46±0.02、2.30±0.06、0.23±0.02。輕度牙周炎組和重度牙周炎組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；重度牙周炎組和正常對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖1 Western blot檢測不同組牙周膜中PD-L1的表達(dá)Fig 1 The expression of PD-L1 in different groups of parodontiumby Western blot

2.5 免疫組織化學(xué)結(jié)果

收集不同組牙齦組織做石蠟切片，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖2。由圖2可見，陰性對照組中無PDL1表達(dá)，其他各組牙齦中均有PD-L1的表達(dá)，輕度牙周炎患者牙齦中PD-L1的表達(dá)高于重度牙周炎。

圖2 不同組牙齦PD-L1的表達(dá) 免疫組織化學(xué) × 400Fig 2 The expression of PD-L1 in different groups of gingival immunohistochemistry × 400

3 討論

既往研究[6,10]表明，腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1與T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合后，形成共抑制分子，減少細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-2、IFN-γ、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的產(chǎn)生，抑制T細(xì)胞的增殖分化，損害T細(xì)胞的新陳代謝，抑制抗凋亡蛋白Bcl-X2的分泌，導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭或凋亡，造成腫瘤的免疫逃逸。同時，PD-L1在腫瘤的轉(zhuǎn)移和發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，PD-L1表達(dá)高者癌癥患者預(yù)后差[4]。

慢性牙周炎牙周組織的破壞，除了病原微生物及其分泌物直接損傷外，炎癥細(xì)胞及其分泌的炎癥因子發(fā)揮至關(guān)重要的作用[1]。炎癥細(xì)胞不僅可以分泌基質(zhì)金屬蛋白酶等直接破壞組織，還可以分泌IL-1、核因子-κB受體活化因子配體等炎癥因子活化破骨細(xì)胞促進(jìn)牙槽骨吸收。本課題的研究結(jié)果顯示：在輕度牙周炎組織中PD-L1高表達(dá)，而重度牙周炎組織中PD-L1表達(dá)顯著減少。PD-L1作為一種保護(hù)性配體在慢性牙周炎中發(fā)揮重要作用。PD-L1抑制牙周組織炎癥的機(jī)制可能是減少TNF-α的表達(dá)以及刺激CD11c+CD11b+固有層細(xì)胞分泌IL-22。TNF-α刺激T細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，是加速炎癥反應(yīng)的一個重要細(xì)胞因子，而PD-L1可能是抑制TNF-α產(chǎn)生的一個重要因素。在黏膜感染的過程中，IL-22啟動固有免疫并且促進(jìn)上皮細(xì)胞的修復(fù)，PD-L1可能刺激IL-22的分泌，從而加速黏膜上皮細(xì)胞的自我修復(fù)和生長，最終在控制牙周組織的炎癥反應(yīng)中起至關(guān)重要的作用。組織受到感染后，PD-L1本身并不能影響組織修復(fù)，但可能有抑制上皮細(xì)胞凋亡和壞死的作用。此外，在牙周組織的炎癥反應(yīng)過程中，PD-L1可能有維持黏膜上皮完整性以及抑制共生菌過度繁殖的作用[11]?？傊琍D-L1的高表達(dá)，抑制了炎癥細(xì)胞活化、增殖和分泌炎癥因子，減少了炎癥因子對組織的破壞。在重度牙周炎組中，發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)減少，不排除實驗中存在個體差異，推測信號通路的多樣性及分子之間多元性的相互交錯最終產(chǎn)生了這一現(xiàn)象，但是究竟是PD-L1的減少加重了炎癥程度還是炎癥的繼續(xù)發(fā)展導(dǎo)致了PD-L1的減少還不明確，還亟需針對這一現(xiàn)象的研究。

新近研究[12]表明，牙周炎組外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-L1的陽性表達(dá)率顯著高于健康對照組，可能是因為PD-L1在外周血淋巴細(xì)胞表面和薄壁組織細(xì)胞表面發(fā)揮不同的作用。在慢性感染過程中，外周血淋巴細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)受到刺激后上調(diào)，抑制CD8+T的免疫反應(yīng)，負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能。然而，薄壁組織細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)的上調(diào)對控制組織的炎癥反應(yīng)有重要作用[13]。

綜上所述，PD-L1在牙周組織的表達(dá)對牙周炎癥反應(yīng)發(fā)揮重要的負(fù)性調(diào)控作用，對牙周組織起保護(hù)性效應(yīng)。這提示，特異性靶向增強(qiáng)PD-L1的活性可能對慢性牙周炎的治療和控制有有利作用。本實驗的結(jié)果為牙周炎的預(yù)后和治療提供了潛在的研究價值，同時也拓寬了PD-L1在免疫學(xué)中的重要作用，為以后研究PD-L1與慢性牙周炎的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

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