崔博淼 余宇 袁雯雯 周聞捷 周學(xué)東 張平

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院（四川大學(xué)），成都 610041

唾液在維護(hù)口腔健康和微生態(tài)平衡的同時(shí)，也存在很多在疾病發(fā)生中起重要作用的成分。唾液作為人體自身分泌的一種生理物質(zhì)，組成成分復(fù)雜多樣，可以在唾液中穩(wěn)定存在的蛋白質(zhì)有90多種[1]。目前已經(jīng)分離出40余種唾液蛋白，其中白蛋白和球蛋白是較重要的唾液功能蛋白，也是體液免疫的重要成分[2]。已知有多種口腔疾病都會(huì)在唾液中得以體現(xiàn)，如甲狀腺炎、糖尿病、牙周炎、慢性腎炎等疾病都可以影響唾液蛋白成分[3-5]。

近幾年，人們對(duì)唾液有了新的認(rèn)識(shí)，并試圖通過(guò)檢測(cè)唾液成分作為診斷疾病的工具，開(kāi)發(fā)一種無(wú)創(chuàng)傷疾病檢測(cè)的新方法。唾液成分及量的改變與口腔疾病、機(jī)體代謝功能改變密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)37名健康受試者及24名發(fā)生牙周炎患者全唾液中的總蛋白和部分唾液蛋白組分進(jìn)行定量分析，確定其參考范圍，以便為口腔疾病的診斷治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

本實(shí)驗(yàn)收集37名健康受試者以及24名慢性牙周炎患者的全唾液。61名研究對(duì)象為23～36歲，平均（28.57±0.69）歲。所有對(duì)象均無(wú)全身系統(tǒng)性疾病。健康受試者要求無(wú)口腔疾病，無(wú)飲酒吸煙史。

1.2 樣品收集和保存

分別采集37名健康受試者1 d內(nèi)8:00、9:30、11:30、13:00、16:30、21:00左右的全唾液以及24名牙周炎患者早晨的非刺激全唾液。在收集唾液之前，要求研究對(duì)象用清水漱口，5 min后開(kāi)始收集唾液。

唾液樣品收集完畢后，在10 000 r·min-1、4 ℃條件下離心10 min，所得上清液分裝入兩個(gè)EP管中，一管300 μL，另一管100 μL。300 μL用于白蛋白檢測(cè)，100 μL用于總蛋白檢測(cè)，并加入500 μL PBS液稀釋6倍。標(biāo)記后分別將上清液-75 ℃冷凍保存[6]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 儀器與試劑 BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Varioskan Flash（Thermo公司，美國(guó)）。GF-D800型半自動(dòng)生化分析儀（山東高密彩虹分析儀器有限公司），白蛋白測(cè)試盒（長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司）。

1.3.2 檢測(cè)方法 采用BCA法在酶標(biāo)儀上測(cè)定總蛋白的質(zhì)量濃度。白蛋白的質(zhì)量濃度使用GF-D800型半自動(dòng)生化分析儀和白蛋白測(cè)試盒采用溴甲酚綠法進(jìn)行測(cè)定，儀器參數(shù)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求設(shè)置。得到總蛋白和白蛋白的測(cè)定結(jié)果后，再由總蛋白減去白蛋白得到球蛋白的質(zhì)量濃度，然后計(jì)算白蛋白與球蛋白比值（albumin/globulin ratio，A/G）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。先對(duì)所得的每一組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，再對(duì)健康組的6組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并使用LSD法進(jìn)行兩兩比較；然后使用秩和檢驗(yàn)分析牙周炎組與健康組相應(yīng)時(shí)間段的數(shù)據(jù)之間的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 健康組唾液蛋白含量檢測(cè)分析

37名健康受試者在1 d內(nèi)6個(gè)時(shí)間段的唾液總蛋白、白蛋白、球蛋白的質(zhì)量濃度及A/G結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 健康組各時(shí)間段總蛋白、白蛋白、球蛋白質(zhì)量濃度及A/G測(cè)量值Tab 1 The mean concentration of total protein, albumin, globulin and A/G of healthy group in different period of time x±s

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，1 d內(nèi)不同時(shí)間段唾液總蛋白、白蛋白、球蛋白的質(zhì)量濃度有明顯波動(dòng)（P＜0.05）；但A/G在1 d內(nèi)的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

測(cè)定的唾液總蛋白、白蛋白、球蛋白質(zhì)量濃度的范圍（95%可信區(qū)間）見(jiàn)表2，經(jīng)方差分析結(jié)果表明：早晨空腹時(shí)（即8:00）不同人唾液蛋白成分的質(zhì)量濃度較為相似，比較穩(wěn)定，唾液總蛋白為1 197.02～1 511.68 μg·mL-1，白蛋白為128.57～150.53 μg·mL-1，球蛋白為1 066.10～1 357.50 μg·mL-1，A/G為0.094 0～0.143 2。

表2 健康組各時(shí)間段總蛋白、白蛋白、球蛋白質(zhì)量濃度及A/G的95%可信區(qū)間Tab 2 95% con fi dence interval of total protein, albumin, globulin and A/G of healthy group in different period of time

2.2 牙周炎組唾液蛋白質(zhì)量濃度檢測(cè)及對(duì)比分析

通過(guò)對(duì)健康組唾液蛋白檢測(cè)分析可以確定早晨唾液蛋白成分較為穩(wěn)定，收集牙周炎患者早晨的全唾液，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)健康組和牙周炎組相同時(shí)段的數(shù)據(jù)進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，結(jié)果顯示兩組間總蛋白、白蛋白、球蛋白的質(zhì)量濃度的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而A/G的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與健康組比較，牙周炎組總蛋白、白蛋白、球蛋白95%可信區(qū)間的下限較健康組相應(yīng)蛋白的上限高，但是牙周炎組與健康組的A/G并無(wú)明顯的差異。

表3 牙周炎組早晨唾液總蛋白、白蛋白、球蛋白質(zhì)量濃度和A/G的均值及95%可信區(qū)間Tab 3 The mean concentration and 95% con fi dence in-terval of total protein, albumin, globulin and A/Gof chronic periodontitis group in the morning

3 討論

唾液是由下頜下腺、舌下腺和腮腺分泌的液體與口腔中眾多小黏液腺分泌的黏液在口腔中混合而成的一種無(wú)色液體，包含無(wú)機(jī)物、黏液、糖蛋白、酶和包括分泌型免疫球蛋白與溶菌酶在內(nèi)的抗菌化合物等。唾液中的酶是淀粉和脂肪消化過(guò)程中必不可少的一部分。這些酶在分解截留于牙齒縫隙中的食物顆粒中發(fā)揮了重要作用，保護(hù)牙齒免受細(xì)菌的損壞。此外，唾液還具有潤(rùn)滑功能，濕潤(rùn)食物使之易于下咽，并保護(hù)口腔黏膜，保持表面濕潤(rùn)。唾液蛋白濃度變化受多種因素的影響[7]。由于唾液蛋白的緩沖作用，唾液的pH值一般為4～5，pH值降低會(huì)導(dǎo)致流率增加，從而導(dǎo)致唾液蛋白濃度下降，即刺激性唾液蛋白的質(zhì)量濃度較非刺激性唾液有所下降[8]。在患者存在接受放射治療或化學(xué)治療、免疫力低下和糖尿病等情況下，唾液白蛋白的濃度會(huì)升高，這對(duì)糖尿病的診斷有一定幫助[5]；此外，口腔鱗狀細(xì)胞癌患者、牙周炎和牙齦炎患者的唾液總蛋白、白蛋白濃度會(huì)明顯增加，因此唾液白蛋白水平可作為這些口腔疾病的診斷指標(biāo)[3,9-10]。有文獻(xiàn)[11]報(bào)道，基本已確定的牙周炎生物標(biāo)志物有基質(zhì)金屬蛋白酶-8、白細(xì)胞介素-1β，這為有效而準(zhǔn)確地診斷牙周炎提供了依據(jù)。

本研究取37名健康受試者在1 d內(nèi)6個(gè)時(shí)間段的非刺激性全唾液，其中8:00、11:30、16:30、21:00為飯前水平，9:30、13:00為飯后水平。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示：1 d內(nèi)6個(gè)時(shí)間段唾液總蛋白、白蛋白、球蛋白的質(zhì)量濃度隨時(shí)間呈現(xiàn)出一定的變化（P＜0.05），主要是飯前水平與飯后水平間的差異，但是A/G在1 d內(nèi)并無(wú)明顯改變（P＞0.05）。造成飯前飯后唾液蛋白質(zhì)量濃度差異的原因是多方面的，如唾液蛋白質(zhì)量濃度會(huì)隨著其pH值的降低而下降。此外，唾液分泌也受到副交感神經(jīng)和交感神經(jīng)的支配，以副交感神經(jīng)為主。人體進(jìn)食及其后的消化過(guò)程中唾液分泌有所改變，主要是因?yàn)楦苯桓猩窠?jīng)興奮所致，使血管擴(kuò)張，毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)，唾液中白蛋白增多，促進(jìn)腺體分泌黏稠唾液[12-13]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，早晨空腹時(shí)（8:00）唾液蛋白成分的含量比較穩(wěn)定，唾液蛋白質(zhì)量的濃度范圍為總蛋白1 197.02～1 511.68 μg·mL-1，白蛋白128.57～150.53 μg·mL-1，球蛋白1 066.10～1 357.50 μg·mL-1，A/G 0.094 0～0.143 2。這與已報(bào)道[7,12-14]的唾液總蛋白、白蛋白量相符合?；诖?，24名牙周炎患者的唾液收集時(shí)間定為早晨。使用秩和檢驗(yàn)，對(duì)牙周炎組與健康組相應(yīng)時(shí)間段的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果顯示：唾液總蛋白、白蛋白、球蛋白均有明顯差異（P＜0.05），且疾病組較健康組高，但是A/G無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

目前，醫(yī)院檢測(cè)疾病的方法主要是采用的血液檢驗(yàn)，其參考值為總蛋白60.0～83.0 g·L-1，白蛋白35～55 g·L-1，球蛋白19～34 g·L-1，A/G1.20～2.50。白蛋白是最豐富的血清蛋白，由肝臟合成，占血漿總蛋白質(zhì)的40%～60%。A/G過(guò)低一般會(huì)考慮是否為肝損傷，而過(guò)高一般是因?yàn)闄C(jī)體失水過(guò)多，血液濃縮或攝入蛋白量過(guò)高所致，是評(píng)價(jià)肝功能重要的生化指標(biāo)。唾液中的白蛋白被視為超濾液，可由血液擴(kuò)散成為黏膜分泌物[5]。此外，有報(bào)道稱唾液白蛋白含量與血清中白蛋白水平存在顯著相關(guān)性[15]。這為使用唾液這種無(wú)創(chuàng)的疾病檢測(cè)方法的研究提供了科學(xué)基礎(chǔ)。但是，唾液白蛋白的濃度會(huì)受到很多因素的影響，比如黏膜有損傷的患者的唾液白蛋白濃度會(huì)顯著升高[12]；放射治療和牙周炎患者也都已經(jīng)檢測(cè)出較高質(zhì)量濃度的白蛋白[5,14]。疾病發(fā)生引起唾液組分改變的作用機(jī)制以及關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。近年來(lái)，有關(guān)唾液的研究已逐漸引起關(guān)注，學(xué)者們正為開(kāi)發(fā)一種無(wú)創(chuàng)檢測(cè)方法進(jìn)行疾病診斷和預(yù)防作出努力。

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