范春麗，王 穎

（1. 鄭州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450044；2. 廣東石油化工學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，廣東 茂名 525000）

植物離體培養(yǎng)和誘發(fā)突變相結(jié)合是植物品質(zhì)改良的途徑之一[1]。以組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)的離體誘變技術(shù)能有效地篩選并可再生出遺傳性穩(wěn)定的突變植株[2]，離體培養(yǎng)可以促進(jìn)變異的分離和純化，縮短育種周期從而提高育種頻率[3-4]。目前誘變與生物技術(shù)相結(jié)合已成為發(fā)展趨勢，誘變技術(shù)的新發(fā)展與植物生物技術(shù)科學(xué)息息相關(guān)[5]。把植物生物技術(shù)引進(jìn)到誘變育種中來，將使后者的處理對象從種子、植株或其他器官組織擴大到細(xì)胞與DNA 分子上，大大拓寬誘變處理的工作領(lǐng)域，推動誘變技術(shù)朝縱深方向發(fā)展，把誘變育種推到一個嶄新的境界。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，這些技術(shù)應(yīng)用到植物誘變育種上來，使高等植物的突變機理在DNA 水平上得到深刻的闡明，從而可望解決植物誘變育種的定向突變問題。但是，關(guān)于誘變處理與組織培養(yǎng)合適結(jié)合方式，處理條件、時期及變異體的選擇方式等一系列問題都有待進(jìn)行廣泛深入的研究，以形成新的育種途徑。油菜是我國最重要的油料作物，但輻射對油菜離體培養(yǎng)效應(yīng)的研究還沒有報道，試驗采用60Co-γ 射線對種子和預(yù)培養(yǎng)的外植體進(jìn)行輻射，探討輻射對下胚軸再生的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為兩個甘藍(lán)型黃籽油菜品種SH31 和K81，一個甘藍(lán)型黑籽油菜品種P52，其中K81 為雙單倍體。材料均由西南大學(xué)油菜研究中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 輻射種子 將種子裝入小型塑料瓶中進(jìn)行輻射，劑量率為1.809 7 Gy/min，劑量設(shè)置0、400、800、1200 Gy，輻射后種子用75%酒精處理1 min，無菌水沖洗后用0.1%HgCl2滅菌12 m in，無菌水沖洗3次，播種于無激素的MS 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d 后取無菌苗的下胚軸切成0.5～1 cm 的小段接種于預(yù)培養(yǎng)基，4 d 后，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，30 d 后統(tǒng)計出芽數(shù)。

1.2.2 輻射下胚軸 未經(jīng)輻射的無菌苗培養(yǎng)7 d，取下胚軸切成0.5～1.0 cm 的小段接種于預(yù)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2～4 d 后輻射，劑量率為1.809 7 Gy/m in，劑量設(shè)置0、10、20、30、40、50、60、80、100 Gy。輻射后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，30 d 后統(tǒng)計出芽數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻射種子對下胚軸分化的影響

輻射后的種子經(jīng)培養(yǎng)萌發(fā)出幼苗，切取下胚軸進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，4 d 后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，從表1 中可看出，出芽率隨著輻射劑量的增加而降低，輻射對愈傷組織誘導(dǎo)影響不大，分化受到較大的影響，經(jīng)1 200 Gy 照射后下胚軸分化頻率下降至62.90%，比對照低20.57個百分點。這表明，輻射種子降低了下胚軸的分化能力。

表1 輻射種子對下胚軸分化的影響

2.2 輻射下胚軸段對下胚軸再生的影響

切取無菌苗下胚軸經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后，用不同劑量的γ射線輻射，結(jié)果從表2 中可以看出，低劑量的輻射對愈傷組織誘導(dǎo)沒有大的影響，但可促進(jìn)芽的再生，10～30 Gy 輻射對芽的再生均有促進(jìn)作用，以20 Gy 輻射效果最明顯，再生頻率提高近9個百分點，且比對照提前3～5 d 出芽。但是高劑量的輻射卻抑制芽的再生，輻射后3 d，40 Gy 以上劑量照射的下胚軸均出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，且芽再生率呈下降趨勢；超過80 Gy 輻射，下胚軸褐化嚴(yán)重，愈傷組織很少形成，但仍有少量再生出芽；100 Gy 輻射后下胚軸大部分褐化死亡，外植體極少形成愈傷組織，也基本上沒有芽再生；100 Gy照射后的，基本上沒有芽再生。

2.3 不同品種對下胚軸輻射的影響

輻射對離體培養(yǎng)產(chǎn)生的效應(yīng)，不同品種間差異很大，以40 Gy 輻射為例，在照射后3 d，K81 和SH31 就出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，其中K81 在低劑量20 Gy 就出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，P52 在40 Gy 照射后，僅出現(xiàn)輕微的褐化，從出芽率來看，黑籽品種P52 經(jīng)照射后，出芽率降低13.02個百分點，SH31 降低31.43個百分點，K81 降低44.66個百分點，這表明不同品種對輻射的敏感性不同，P52更耐輻射。

2.4 預(yù)培養(yǎng)時間對下胚軸段輻射的影響

未經(jīng)輻射處理的下胚軸預(yù)培養(yǎng)2 d 和4 d 對分化影響不大[6]，但預(yù)培養(yǎng)時間對下胚軸再生的影響很大。由表4 可看出，預(yù)培養(yǎng)2 d 后輻射，下胚軸再生頻率明顯低于預(yù)培養(yǎng)4 d 后輻射。并且劑量越高影響越明顯，預(yù)培養(yǎng)2 d 后40 Gy 照射，出現(xiàn)大量褐化死亡，在80 Gy 以上沒有再生出苗。這說明4 d 時間的預(yù)培養(yǎng)有利于降低輻射對外植體的損傷，從而有利于芽的再生。

表2 輻射下胚軸段對下胚軸再生的影響

表3 不同品種對下胚軸輻射再生的影響

表4 預(yù)培養(yǎng)時間對下胚軸輻射再生的影響

3 小結(jié)與討論

近年來，組培技術(shù)和誘變技術(shù)相結(jié)合在農(nóng)作物、蔬菜、果樹和育種上大量應(yīng)用，培育出不少新品種[7-11]。在水稻中低劑量的輻射愈傷組織，可提高愈傷組織的分化頻率[12]，青菜預(yù)培養(yǎng)的外植體經(jīng)低劑量輻射處理后能促進(jìn)不定芽的再生[13]。另有研究表明，在大豆的基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化中，低劑量的輻射處理可提高轉(zhuǎn)化成功率。對于油菜再生和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的研究，已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但普遍存在再生頻率較低的現(xiàn)象。本試驗結(jié)果表明下胚軸預(yù)培養(yǎng)4 d 后，采用20 Gy γ 射線輻射處理，可明顯提高油菜下胚軸的再生頻率，40 Gy 以上劑量處理預(yù)培養(yǎng)的下胚軸，再生頻率開始下降，60 Gy 以上輻射處理，愈傷組織誘導(dǎo)和再生受到明顯的抑制，80 Gy 輻射處理后沒有再生出苗，這對后期篩選變異是很有意義的。不同品種在離體培養(yǎng)中對輻射的效應(yīng)存在較大差異，其中黑籽油菜較黃籽油菜耐輻射，這與種子輻射的結(jié)果是一致的。

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