田玉民，蘇玉虹，王玉彬，高群，張會(huì)君，王鐵良

（遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001）

抗野豬和地方豬仔豬營(yíng)養(yǎng)性腹瀉的研究

田玉民，蘇玉虹，王玉彬，高群，張會(huì)君，王鐵良

（遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001）

野豬和地方豬養(yǎng)殖過(guò)程中仔豬營(yíng)養(yǎng)性腹瀉率高，嚴(yán)重地影響了養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序，檢測(cè)到豬乳糖酶基因（LCT）5′非編碼區(qū)增強(qiáng)子和啟動(dòng)子多態(tài)性位點(diǎn)；通過(guò)雙熒光報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)，確定了LCT多態(tài)性位點(diǎn)調(diào)控基因的表達(dá)；經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，LCT多態(tài)性與仔豬乳糖消化性狀相關(guān)顯著。通過(guò)飼養(yǎng)試驗(yàn)，篩選了抗腹瀉飼料添加劑。上述研究形成了抗野豬和地方豬仔豬營(yíng)養(yǎng)性腹瀉的綜合配套技術(shù)，為后續(xù)推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

野豬仔豬；地方豬仔豬；營(yíng)養(yǎng)性腹瀉；乳糖酶基因；飼料添加劑

豬肉是我國(guó)肉類消費(fèi)的主體，占肉類總消費(fèi)的60%以上[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年我國(guó)豬肉產(chǎn)量5 342.7萬(wàn)噸，人均豬肉消費(fèi)量38.7 kg，豬肉消費(fèi)基本趨于飽和，消費(fèi)理念由追求數(shù)量轉(zhuǎn)向追求質(zhì)量[2]。與國(guó)內(nèi)占優(yōu)勢(shì)的國(guó)外豬種相比，我國(guó)地方豬肉質(zhì)在色澤、嫩度、大理石紋、pH值、系水力及脂肪酸含量等方面均有不同程度的優(yōu)勢(shì)[3]，地方豬和野豬豬肉產(chǎn)品在豬肉供應(yīng)市場(chǎng)上占有一定的份額，并有逐步提高的趨勢(shì)，地方豬的養(yǎng)殖生產(chǎn)在逐步走向規(guī)?；?/p>

隨著地方豬和野豬生產(chǎn)的規(guī)?；?，疫病防控、繁殖、營(yíng)養(yǎng)飼料等一些問(wèn)題也逐漸暴露出來(lái)，特別是仔豬腹瀉率高、成活率低的問(wèn)題比較突出。2010年，本研究團(tuán)隊(duì)在與企業(yè)產(chǎn)學(xué)研合作過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，即使在豬群健康狀況非常良好、飼料配方和飼料原料來(lái)源比較穩(wěn)定時(shí)，野豬和地方豬仔豬腹瀉率也比較高，成為制約經(jīng)濟(jì)效益的重要因素之一。本研究圍繞這一現(xiàn)象開(kāi)展了相關(guān)調(diào)查和試驗(yàn)研究，最終確定為營(yíng)養(yǎng)性腹瀉，通過(guò)分子遺傳學(xué)方法探明了該腹瀉的發(fā)生原因，并開(kāi)發(fā)出了相應(yīng)的抗腹瀉飼料添加劑和分子輔助育種技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 豬LCT基因的多態(tài)性及對(duì)基因表達(dá)的影響采取大白豬、長(zhǎng)白豬、杜洛克、荷包豬、民豬、長(zhǎng)白山野豬仔豬耳組織樣本，提取DNA，通過(guò)對(duì)乳糖酶（lactase,LCT）基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序，獲得LCT基因5'非編碼區(qū)增強(qiáng)子和啟動(dòng)子多態(tài)性位點(diǎn)[4]。通過(guò)單倍型雙熒光報(bào)告系統(tǒng)試驗(yàn)，確定LCT多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)基因表達(dá)的影響[5]。

1.2 LCT基因的多態(tài)性與仔豬營(yíng)養(yǎng)性腹瀉的相關(guān)分析取荷包豬、民豬、長(zhǎng)白山野豬腹瀉仔豬糞便，測(cè)定糞便乳糖和pH；取仔豬耳組織樣本，提取DNA，分析LCT基因多態(tài)性，并采用SPSS軟件包（version 17.0）分析該多態(tài)性與仔豬腹瀉的相關(guān)關(guān)系[6]。

1.3 抗仔豬營(yíng)養(yǎng)性腹瀉飼料添加劑的篩選經(jīng)挑選整齊的野豬和荷包豬仔豬（哺乳和攝入含乳制品仔豬料）135頭，隨機(jī)分為9個(gè)處理組，每組15頭，每組分3個(gè)重復(fù)。第1組為空白對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)日糧；第2組飼喂寡果糖—FOS（150 mg/kg）；第3組飼喂寡甘露糖—MOS（200 mg/kg）；第4組飼喂寡果糖（150 mg/kg）和寡甘露糖（200 mg/kg）；第5組飼喂檸檬酸—CA（800 mg/kg）；第6組飼喂寡果糖（150 mg/kg）、寡甘露糖（200 mg/kg）和檸檬酸（800 mg/kg）；第7組飼喂乳糖酶—LA（540 U/ kg）；第8組飼喂乳糖酶—LA（540 U/kg）和檸檬酸（800 mg/kg）；第9組飼喂乳糖酶（540 U/kg）、檸檬酸（800 mg/kg）、寡果糖（150 mg/kg）和寡甘露糖（200 mg/kg）。日糧參照NRC（1998）《豬營(yíng)養(yǎng)需要》配制，試驗(yàn)豬群飼喂粉料，自由飲水，試驗(yàn)期42 d[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬LCT基因的多態(tài)性及對(duì)基因表達(dá)的影響通過(guò)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增后測(cè)序，發(fā)現(xiàn)豬LCT基因5'非編碼區(qū)增強(qiáng)子第-797位出現(xiàn)G或A的單核苷酸多態(tài)性；啟動(dòng)子區(qū)第-308位為G或C的單核苷酸多態(tài)性；啟動(dòng)子區(qū)第-301位為A或G的單核苷酸多態(tài)性。其中啟動(dòng)子區(qū)-308位與-301位是對(duì)應(yīng)的關(guān)系，即啟動(dòng)子區(qū)-308位為G時(shí)，-301位為A；當(dāng)啟動(dòng)子區(qū)-308位為C時(shí)，-301位為G，因此構(gòu)成單倍型GA和CG[6]。

通過(guò)雙熒光報(bào)告系統(tǒng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子GA和CG相比差異極顯著。啟動(dòng)子CG強(qiáng)烈促進(jìn)基因表達(dá)，而GA不能促進(jìn)基因表達(dá)。增強(qiáng)子A，對(duì)于啟動(dòng)子GA來(lái)說(shuō)，使啟動(dòng)子GA活性顯著增強(qiáng)（P＜0.05）；對(duì)于啟動(dòng)子CG來(lái)說(shuō)，卻是抑制子，使啟動(dòng)子CG活性極顯著降低（P＜0.01）。增強(qiáng)子G，無(wú)論是哪一種啟動(dòng)子，均起極顯著的抑制作用（P＜0.01）。豬LCT增強(qiáng)子和啟動(dòng)子多態(tài)性位點(diǎn)組合形成的單倍型促進(jìn)基因表達(dá)的作用從高到低順序?yàn)椋涸鰪?qiáng)子A﹢啟動(dòng)子GA＞增強(qiáng)子A/G﹢啟動(dòng)子CG＞增強(qiáng)子G﹢啟動(dòng)子GA[5-6]。

2.2 LCT基因的多態(tài)性與仔豬營(yíng)養(yǎng)性腹瀉的相關(guān)分析采用SPSS軟件包（version 17.0）的統(tǒng)計(jì)模型分析基因型與乳糖不耐受性腹瀉的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果表明，SNP G-797A的GG基因型、SNP G-308C和SNP A-301G的GAGA基因型分別與地方豬和野豬的乳糖不耐受性腹瀉顯著相關(guān)，其他基因型與野豬/地方豬或引進(jìn)豬種中乳糖不耐受性腹瀉性狀相關(guān)不顯著[6]。

2.3 抗仔豬營(yíng)養(yǎng)性腹瀉飼料添加劑的篩選試驗(yàn)結(jié)果表明，所涉及到的4種添加劑具有相當(dāng)好的協(xié)同性和互補(bǔ)性，是單一原料所不能替代的，見(jiàn)表1[7]。從試驗(yàn)數(shù)據(jù)反映出，造成仔豬腹瀉是各種原因綜合作用的結(jié)果，其中營(yíng)養(yǎng)性腹瀉是主要原因，消化道胃酸分泌不足、微生態(tài)平衡不佳是次要原因。4種成分針對(duì)仔豬腹瀉主次兼顧，因此聯(lián)合使用獲得較好的預(yù)防效果。

3 討論

本研究團(tuán)隊(duì)在與以飼養(yǎng)野豬和地方豬為主的養(yǎng)豬企業(yè)產(chǎn)學(xué)研合作過(guò)程中，豬場(chǎng)提出哺乳仔豬腹瀉率高。針對(duì)這一問(wèn)題，組織了專家對(duì)豬場(chǎng)進(jìn)行了調(diào)查研究，包括豬場(chǎng)的防疫和歷史疫病發(fā)生情況、泌乳母豬的健康狀況、日糧/飼糧配方及飼料原料質(zhì)量、豬場(chǎng)的生產(chǎn)管理等。與引進(jìn)豬種相比，未發(fā)現(xiàn)引起仔豬腹瀉的誘因。受人類乳糖不耐受癥的啟發(fā)，測(cè)定了腹瀉仔豬的糞便，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)腹瀉仔豬糞便中含未被消化吸收的乳糖，由此初步判斷仔豬可能由于乳糖酶（LCT）分泌不足而引起營(yíng)養(yǎng)性腹瀉。本課題組通過(guò)生產(chǎn)試驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室兩方面研究確認(rèn)其原因是小腸中消化乳汁乳糖的LCT缺乏所致，并由此建立了分子標(biāo)記輔助選擇（marker assisted selection,MAS）育種技術(shù)，研制出有效的治療和預(yù)防仔豬腹瀉的飼料添加劑，獲得了2項(xiàng)國(guó)家授權(quán)發(fā)明專利[6-7]，形成抗野豬和地方豬仔豬營(yíng)養(yǎng)性腹瀉的綜合配套技術(shù)。

表1 添加劑抗地方豬仔豬腹瀉的效果分析Table1 The effect of the additives of local pig diarrhea piglets analysis

3.1 仔豬LCT基因的分子標(biāo)記輔助育種根據(jù)2.1和2.2的試驗(yàn)結(jié)果，在進(jìn)行地方豬或野豬的純繁、以及地方豬或野豬與引進(jìn)豬種的雜交育種過(guò)程中，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇（MAS），淘汰SNP G-797A的GG基因型或SNP G-308C和SNP A-301G的 GAGA基因型或單倍型GAGA個(gè)體，可以避免后代出現(xiàn)仔豬營(yíng)養(yǎng)性腹瀉，顯著提高豬群仔豬消化乳糖能力，減少由于LCT缺乏引起的仔豬腹瀉，降低仔豬死亡率。

3.2 抗腹瀉飼料添加劑的應(yīng)用本研究所篩選的添加劑具有4方面優(yōu)點(diǎn)：①可以降低仔豬的腹瀉率。哺乳和攝入含乳制品仔豬料的野豬及地方豬仔豬腹瀉率降低80%以上，健康狀況得到顯著改善。②可以提高仔豬成活率。由于有效抑制了腹瀉，仔豬的采食量增加，疾病發(fā)生率顯著降低，因而成活率明顯提高。③可以提高日增重。由于健康狀況得到改善，采食量增加，使仔豬日增重顯著提高，不僅提高了仔豬階段的日增重，也對(duì)后期生長(zhǎng)肥育階段的日增重有一定作用。④本飼料添加劑不影響食品安全，無(wú)環(huán)境污染。所用產(chǎn)品包括安全、高效的酶制劑，來(lái)源于天然原料的寡果糖和寡甘露糖，廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)的檸檬酸，因此本產(chǎn)品不會(huì)影響生豬食品安全，也不會(huì)帶來(lái)環(huán)境污染，更不會(huì)產(chǎn)生耐藥性等問(wèn)題，是安全、高效、環(huán)保的飼料添加劑。

3.3 進(jìn)一步的工作本研究所形成的抗野豬和地方豬仔豬營(yíng)養(yǎng)性腹瀉綜合技術(shù)如果能夠大范圍推廣應(yīng)用，可以使野豬和地方豬飼養(yǎng)成本顯著降低，保障養(yǎng)豬企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益，有利于擴(kuò)大野豬和地方豬飼養(yǎng)規(guī)模和產(chǎn)業(yè)化水平，進(jìn)一步調(diào)動(dòng)農(nóng)民利用自然資源飼養(yǎng)野豬和地方豬的積極性，有利于和諧社會(huì)的建設(shè)和發(fā)展。

[1]陳瓊，王濟(jì)民.我國(guó)肉類消費(fèi)現(xiàn)狀與未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2013（6）：43-47.

[2]楊紅杰，彭華，王林云.從我國(guó)豬肉消費(fèi)趨勢(shì)展望地方豬種發(fā)展前景[J].中國(guó)畜牧雜志，2014，50（16）：6-10.

[3]薛尚軍，楊曉?shī)^，劉宏，等.中國(guó)地方豬種的肉質(zhì)特性[J].國(guó)外畜牧學(xué)-豬與禽，2011，30（2）：92-94.

[4]杜海廷，趙薇，巴彩鳳，等.豬乳糖酶基因5'非編碼區(qū)多態(tài)性分析[J].畜牧與獸醫(yī)，2013，45（8）：35-49.

[5]Du H T,Zhu H Y,Wang J M,et al.Single-nucleotide polymorphisms and activity analysis of the promoter and enhancer of the pig lactase gene[J].Gene,2014,545(1):56-60.

[6]遼寧醫(yī)學(xué)院，蘇玉虹，田玉民，杜海廷，等.仔豬乳糖消化性狀的LCT基因多態(tài)性檢測(cè)方法及其應(yīng)用[P].中國(guó)：201310339704.3，2013-10-23.

[7]遼寧醫(yī)學(xué)院，田玉民，蘇玉虹.抗野豬和地方豬仔豬腹瀉的飼料添加劑[P].中國(guó)：201110413894.3，2012-04-18.

（編輯：郭雪峰）

Research on Decrease of Nutritional Diarrhea in Boar and Local Piglets

Tian Yumin,Su Yuhong,Wang Yubin,Gao Qun,Zhang Huijun,Wang Tieliang

（Liaoning Medical University,LiaoningJinzhou121001）

High nutritional diarrhea rate in boar and local piglets affected the economic benefits seriously.In this study,the polymorphism loci of pig lactase(LCT)at 5'non-coding enhancer and promoter was detected by PCR and DNA sequencing.And confirmed the regulating genes expression ofLCT polymorphic loci through a experiment with dual luciferase report system.The correlation was significant between the polymorphism of LCT and piglets lactose digestive traits with statistical analysis.Then selected the anti-diarrheal feed additive by feeding trials.The study above formed an integrated technology for controlling nutritional diarrhea in boar and local piglets and laid the foundation for the subsequent application.

Boar Piglet;Local Piglet;Nutritional Diarrhea;Lactase;Feed Additive

S828.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：1672-9692(2015)02-0019-04

2015-01-11

田玉民（1962-），男，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)轱暳腺Y源開(kāi)發(fā)與利用。

遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃一層次項(xiàng)目(LR2013042)