吳　偉，曾倩蘭，向　福*

（1.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北黃州438000；2.湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北黃石435003；3.黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北黃州438000）

響應(yīng)面分析法優(yōu)化火棘果中原花青素提取工藝

吳偉1，2，曾倩蘭2，向福1，3*

（1.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北黃州438000；2.湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北黃石435003；3.黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北黃州438000）

為了優(yōu)化火棘果中原花青素的提取工藝，基于單因素試驗(yàn)的結(jié)果，采用響應(yīng)面分析法探討提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)原花青素提取率的影響，確定火棘果中原花青素最佳提取工藝。結(jié)果表明，最佳提取條件為提取溫度70℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取料液比1∶20（g∶mL）、提取時(shí)間4.0 h、提取3次，在此提取工藝條件下，所得原花青素的提取率為5.74%，與理論提取率接近。

響應(yīng)面分析法；火棘果；原花青素；提取

火棘（Pyracantha fortuneana）又稱火把果、救軍糧，為薔薇科火棘屬植物，屬于常綠灌木［1］?；鸺Y源豐富，具有較高的觀賞價(jià)值，其果實(shí)具有很高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值［2-3］?；鸺麨樵系谋＝」啤嬃系纫呀?jīng)在市面上有售?；鸺乃幱迷凇兜崮媳静荨?、《本草綱目》等都有記載［4］。根主治虛勞骨蒸、濕熱痹痛、月經(jīng)不調(diào)、跌打損傷等癥狀；果實(shí)主治脾胃虛弱、消化不良、泄瀉、痢疾、疳積、崩漏、白帶、產(chǎn)后腹痛等病癥；葉主治血崩及貧血、閉經(jīng)和爆發(fā)性火眼、外敷治療瘡殤腫毒［5］。

原花青素（proanthocyanidins，PC）是含雙黃酮衍生物的天然多酚化合物的總稱，是目前國際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑之一［6-7］。一般為紅棕色粉末，氣微、苦澀，溶于水和大多數(shù)有機(jī)溶劑。原花青素分布廣泛，主要存在于植物的根、莖、葉、皮、殼等，低聚原花青素廣泛存在于各種水果的皮、核、梗中［8］。原花青素是一種新型高效抗氧化劑，是目前為止所發(fā)現(xiàn)的最有效的自由基清除劑，具有非常強(qiáng)的體內(nèi)活性［9］。

響應(yīng)面分析法是目前最常用的工程類優(yōu)化方法，它是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)的綜合實(shí)驗(yàn)技術(shù)，來解決復(fù)雜系統(tǒng)變量與相應(yīng)之間關(guān)系的一種方法，通過對(duì)所需分析的相應(yīng)受多個(gè)變量影響的問題進(jìn)行建模和分析，從而優(yōu)化該響應(yīng)［10］。所以，響應(yīng)面優(yōu)化法廣泛應(yīng)用于生物工程、食品工程以及其他工程領(lǐng)域的過程優(yōu)化［11-12］。目前對(duì)火棘果的研究主要集中在營養(yǎng)成分、功效方面，對(duì)其有效成分如原花青素的的有效提取鮮有報(bào)道。本研究在單因素的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)火棘果中原花青素提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的提取工藝條件，為充分利用火棘果資源提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

火棘果：采自湖北理工學(xué)院植物園，粉碎后保存?zhèn)溆谩?/p>

無水乙醇（分析純）：武漢市洪山中南化工試劑有限責(zé)任公司；兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：上海金穗生物科技有限公司；香草醛（分析純）：湖南湘中地質(zhì)實(shí)驗(yàn)研究所；石油醚（分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；甲醇（分析純）：武漢市洪山中南化工試劑有限責(zé)任公司；鹽酸（分析純）：中平能化集團(tuán)開封東大化工有限公司試劑廠。

1.2儀器與設(shè)備

YP6002電子天平：上海佑科儀器儀表有限公司；SCQ-450超聲波清洗器：上海盛普機(jī)械制造有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海姚氏儀器設(shè)備廠；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；SF-130C萬能粉碎機(jī)：吉首市中誠制藥機(jī)械廠；752SP紫外-可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；HWS26水浴鍋：上海一恒科學(xué)有限公司；AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備［13］

分別吸取質(zhì)量濃度1.0 mg/mL的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)液各0.125 mL、0.250mL、0.375mL、0.500mL、0.625mL、0.750mL、0.875 mL、1.000 mL至25 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20mg/mL、0.25mg/mL、0.30mg/mL、0.35mg/mL、0.40mg/mL，搖勻，再分別加入15 mL 4 g/100 mL香草醛-甲醇溶液和7.5 mL濃鹽酸，定容，混勻。在30℃水浴避光反應(yīng)30 min后，用甲醇代替標(biāo)準(zhǔn)品作空白對(duì)照，于波長500 nm處測定吸光度值，以兒茶素質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，對(duì)吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2樣品溶液的制備與含量測定

將火棘果磨粉過篩后，稱取1 g火棘果粉末，置于圓底燒瓶中，加入適量的乙醇，在一定溫度和時(shí)間下提取，將濾渣再次在相同的條件下提取。合并濾液，減壓濃縮，得到樣品溶液。

根據(jù)兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出原花青素含量，并計(jì)算原花青素的提取率。原花青素的提取率計(jì)算公式如下：

1.3.3單因素試驗(yàn)

分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（65%、70%、75%、80%、85%、90%）、提取溫度（60℃、65℃、70℃、75℃、80℃）、料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶mL））、提取時(shí)間（2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h、4.5 h、5.0 h）和提取次數(shù)（1、2、3、4、5）對(duì)火棘果中原花青素提取率的影響。

1.3.4響應(yīng)面分析試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面分析法對(duì)火棘果中原花青素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，選取提取溫度（X1）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X2）、料液比（X3）3個(gè)因素為自變量，以原花青素提取率（Y）為響應(yīng)面值，并以1、0、-1分別代表自變量的高中低水平，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平如表1所示。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments design

2　結(jié)果與分析

2.1兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以兒茶素質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1　兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of catechin

由圖1可知，兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=7.45x+ 0.010 5，決定系數(shù)R2=0.993 4，表明兒茶素質(zhì)量濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)火棘果中原花青素提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)火棘果中原花青素提取率的影響結(jié)果見圖2。

圖2　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the procyanidins extraction rate

由圖2可得，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%～70%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的變大，原花青素的提取率增大；在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，原花青素的提取率最大，為6.762 1%；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＞70%后，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，提取率變小。這可能是由于“相似相溶”原理，當(dāng)溶劑的極性與原花青素的極性相近時(shí)，原花青素的提取率達(dá)到最大。因此，選取最佳提取乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.2.2提取溫度對(duì)原花青素提取率的影響

提取溫度對(duì)原花青素提取率的影響結(jié)果見圖3。

圖3　提取溫度對(duì)原花青素提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the procyanidins extraction rate

由圖3可得，當(dāng)提取溫度從60℃升至70℃時(shí)，隨著提取溫度的升高，原花青素的提取率變大；當(dāng)溫度達(dá)到70℃時(shí)，提取率達(dá)到最大，為6.721 4%；當(dāng)提取溫度＞70℃后，提取率隨著提取溫度的升高而減小，但提取率比提取溫度在60℃時(shí)高，可能是因?yàn)殡S著提取溫度的升高，原花青素中熱不穩(wěn)定的成分分解［14］。故選最佳提取溫度在70℃。

2.2.3料液比對(duì)原花青素提取率的影響

料液比對(duì)原花青素提取率的影響結(jié)果見圖4。

圖4　料液比對(duì)原花青素提取率的影響Fig.4 Effect of ratio of solid to liquid on the procyanidins extraction rate

由圖4可得，當(dāng)料液比為1∶15～1∶20（g∶mL）時(shí)，隨著料液比的增大，原花青素的提取率變大，溶劑增加后，隨著細(xì)胞破裂加劇，原花青素迅速進(jìn)入溶劑；當(dāng)料液比達(dá)到1∶20（g∶mL）時(shí)，提取率達(dá)到最大，為6.744 2%，原花青素濃度達(dá)到飽和；當(dāng)料液比超過1∶20（g∶mL）后，隨著料液比的增大，提取率變小，原花青素達(dá)到飽和后反而抑制其從細(xì)胞的滲出。故取最佳選料液比在1∶20（g∶mL）。

2.2.4提取時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響結(jié)果見圖5。

圖5　提取時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the procyanidins extraction rate

由圖5可得，當(dāng)提取時(shí)間為2.0～4.0 h時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長，原花青素的提取率增大；當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到4.0 h時(shí)，提取率達(dá)到最大，為6.751 3%；當(dāng)提取時(shí)間超過4.0 h后，隨著提取時(shí)間的延長，提取率減小，可能是隨著提取時(shí)間的延長，原花青素?zé)岵环€(wěn)定的成分分解［15］。綜合考慮選取提取時(shí)間4.0 h進(jìn)行下一步的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.5提取次數(shù)對(duì)原花青素提取率的影響

圖6　提取次數(shù)對(duì)原花青素提取率的影響Fig.6 Effect of extraction times on the procyanidins extraction rate

由圖6可得，隨著提取次數(shù)的增多，提取率增大；當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到3次時(shí)，提取率達(dá)到最大，為6.712 8%，之后提取率變化不大。為了節(jié)約成本故取3次作為響應(yīng)面試驗(yàn)提取條件。

2.3響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

利用Design Expert 8.0.6.1軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到原花青素提取率與提取溫度（X1）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X2）和料液比（X3）的二次多項(xiàng)回歸方程：

2.3.2響應(yīng)面回歸模型方差分析

為了檢驗(yàn)回歸方程的有效性，對(duì)該數(shù)學(xué)模型進(jìn)行回歸方差分析顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

由表3可知，F(xiàn)值反映了各因子對(duì)響應(yīng)值的重要性，F(xiàn)值越大（P值越?。?，表明該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越大。F（X2）＞F（X1）＞F（X3），說明3個(gè)影響因子對(duì)于原花青素提取率的影響強(qiáng)弱順序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞料液比。而對(duì)于顯著性，X12和X22對(duì)響應(yīng)值極顯著（P＜0.000 1）；而X1、X2和X32對(duì)響應(yīng)值有顯著影響（P＜0.05）。雖然3因素的交互作用對(duì)于響應(yīng)值的影響沒有顯著性，但它們與響應(yīng)值之間的關(guān)系并不是簡單的線性，響應(yīng)值同時(shí)也受各因素的二次項(xiàng)的影響。模型的F值為45.49，P＜0.000 1表明該模型具有高度的顯著性，失擬項(xiàng)P值為0.648 2＞0.05，說明該模型失擬項(xiàng)不顯著，即該模型對(duì)于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合度較好。模型的校正決定系數(shù)R2Adj=0.961 6，說明該模型能解釋96.16%響應(yīng)值的變化，未計(jì)入回歸方程的變量對(duì)火棘果中原花青素的提取效果影響比較小。相關(guān)系數(shù)R2=0.983 2，表示該模型擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)的誤差小，可以用該模型來分析和預(yù)測火棘果原花青素的提取率［16］。

表3　回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.3.3響應(yīng)面分析與優(yōu)化

根據(jù)上述回歸方程繪制出響應(yīng)面分析圖，以確認(rèn)提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比3因素對(duì)火棘果中原花青素提取率的影響，響應(yīng)面曲面和等高線見圖7。

圖7　提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比交互作用對(duì)原花青素提取率影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interaction between extraction temperature，alcohol concentration and solid-liquid ratio on procyanidins extraction rate on extraction efficiency

由圖7可知，提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素的提取率影響顯著，因?yàn)樘崛囟群鸵掖俭w積分?jǐn)?shù)對(duì)應(yīng)的曲面較陡，料液比對(duì)原花青素提取率影響作用較弱。等高線可以反映出交互作用的強(qiáng)弱，提取溫度和乙醇濃度交互作用較強(qiáng)，因?yàn)樗鼈兘换プ饔玫牡雀呔€圖為橢圓形，相反，其相互作用的等高線圖為圓形，故提取溫度與料液比的交互作用以及乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比的交互作用較弱。此外，響應(yīng)面均為開口向下的凸面，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和料液比等3個(gè)因素與原花青素提取率基本呈拋物線關(guān)系，表面在試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)可以找出最優(yōu)值。多元回歸模型預(yù)測的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70.60%，提取溫度70.40℃，提取料液比1∶19.24（g∶mL），該條件下綠原酸提取率預(yù)測值為5.771 7%。

2.3.4驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

為了檢驗(yàn)響應(yīng)面模型的有效性，考慮到實(shí)際操作的方便性將各因素修正為提取溫度70℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取料液比1∶20（g∶mL），提取時(shí)間4.0 h，提取次數(shù)3次，在此修正條件下進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，得出實(shí)際提取率為5.74%。驗(yàn)證值與預(yù)測值相接近，說明該模型可以很好地反映出火棘果中原花青素提取條件，響應(yīng)面優(yōu)化回歸模型對(duì)實(shí)際工藝操作具有一定的指導(dǎo)意義。

3　結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理及響應(yīng)面分析法確定了火棘果中原花青素最佳提取工藝條件：提取溫度70℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取料液比1∶20（g∶mL），提取時(shí)間4.0 h，提取次數(shù)3次，在此工藝條件下，測得原花青素的提取率為5.74%，與理論值相近，說明響應(yīng)面法對(duì)火棘果中原花青素提取條件參數(shù)的優(yōu)化是可行的，適合于提取火棘果中原花青素工業(yè)化生產(chǎn)。

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Optimization of extraction process of procyanidins inPyracantha fortuneanafruit by response surface methodology

WU Wei1，2，ZENG Qianlan2，XIANG Fu1，3*
（1.Hubei Collaborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains，Huangzhou 438000，China；2.Medical College，Hubei Polytechnic University，Huangshi 435003，China；3.College of Life Sciences，Huanggang Normal University，Huangzhou 438000，China）

To optimize the extraction process of procyanidins inPyracantha fortuneanafruit，on the base of single factor experiments，the effect of extraction temperature，alcohol concentration，solid-liquid ratio，extraction time and extraction times on procyanidins extraction rate was investigated by response surface methodology.The optimum extraction process of procyanidins inP.fortuneanafruit was determined.The results showed that the optimum extraction conditions were extraction temperature 70℃，ethanol concentration 70%，solid-liquid ratio 1∶20（g∶ml），extraction time 4.0 h，and extraction times 3.Under this conditions，the procyanidins extraction rate was 5.74%，which was approached to the theoretical value.

response surface methodology；Pyracantha fortuneanafruit；procyanidins；extraction

R284.2

A

0254-5071（2015）10-0116-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.026

2015-09-11

大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2015TD07）

吳偉（1979-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)藥物。

向福（1977-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)樘烊恢参镔Y源利用。