謝焰鋒等

摘要：以生長1、2、3個月的巨菌草（Pennisetum sinese）葉片為材料，探討巨菌草葉片單寧成分的提取方法和含量，單寧提取方法采用正交試驗進行優(yōu)化，單寧含量采用福林酚-比色法進行測定。結(jié)果表明，巨菌草單寧最佳提取條件為丙酮體積分數(shù)70%，提取溫度50 ℃，提取時間1 h。生長1、2、3個月的巨菌草葉片的單寧含量分別為8.47、10.44和12.59 mg/g，與其他牧草相比處于中間水平，且單寧含量隨生長時間的延長而增加，不同生長階段的單寧含量適合不同的動物采食。

關(guān)鍵詞：巨菌草（Pennisetum sinese）；牧草；單寧；正交試驗

中圖分類號：S543+.9；TQ943+.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）17-4250-03

巨菌草（Pennisetum sinese）是福建農(nóng)林大學菌草生物工程技術(shù)研究中心從非洲引進的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)菌草，目前在中國福建、寧夏、廣西、浙江、新疆等多個省區(qū)和非洲、美洲的許多國家都有推廣種植。巨菌草是禾本科狼尾草屬（Pennisetum）的植物，可以在熱帶、亞熱帶和溫帶生長，是典型的C4植物，對光照和溫度有較高的需求，植株高大，生長快，產(chǎn)量高，抗逆性強[1-3]。巨菌草是多功能草，其用途廣泛，可以以草代木種植菌菇，作為生物材料來生產(chǎn)紙張、纖維板、活性炭等，用作生物質(zhì)能源發(fā)電的原材料，也可用作環(huán)境恢復(fù)和環(huán)境保護的優(yōu)良植物，此外作為牧草飼養(yǎng)畜禽也是它的一個重要用途[4-9]。巨菌草蛋白質(zhì)含量高，粗蛋白質(zhì)含量18.64%，精蛋白質(zhì)含量16.88%，糖分高，總糖含量8.3%，被稱為“飼草之王”[1]。巨菌草適口性好，葉片柔軟、脆嫩，是牛、馬、羊、豬、兔等家畜，雞、鴨、鵝等家禽和食草性魚喜愛的飼料[1，10]。

單寧通常被認為是牧草中的抗營養(yǎng)因子，一是由于縮合單寧和蛋白質(zhì)、維生素、金屬離子等絡(luò)合，導(dǎo)致這些營養(yǎng)物質(zhì)不能被動物吸收或者利用效率下降；二是單寧味苦具收斂作用，影響飼料的適口性，導(dǎo)致動物的采食量下降；三是單寧會降低動物對養(yǎng)分的消化率并影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。巨菌草作為優(yōu)質(zhì)牧草，其營養(yǎng)成分已經(jīng)有相關(guān)報道[1，10]，但是作為抗營養(yǎng)因子的單寧成分的提取工藝和含量測定尚未見報道。為了更全面地了解巨菌草作為牧草的優(yōu)缺點，對不同生長時期巨菌草葉片中的單寧含量進行了綜合分析，為更好地利用這一資源提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：供試巨菌草樣品采自湖北省武漢市林業(yè)果樹科學研究所武湖基地，不同生長時期的巨菌草葉片采集后陰干，磨粉，儲藏備用。

主要試劑：單寧標準品、福林酚試劑、碳酸鈉、丙酮、去離子水。

主要儀器：i-9型雙光速紫外/可見分光光度計（海能儀器）。

1.2 方法

1.2.1 植物樣品的采集 分別采集生長了1、2、3個月的巨菌草成熟葉片，清洗后自然陰干，磨成粉末備用。

1.2.2 單寧類物質(zhì)的提取 采用浸提法，以水-有機溶劑混合體系為提取溶劑進行提取。在溶劑提取法中，提取時間、提取溫度和溶劑的選擇是影響單寧提取率的重要因素。本試驗以生長3個月的巨菌草葉片為樣品，以丙酮/水為提取溶劑，以提取時間、提取溫度和丙酮體積分數(shù)進行3因素3水平正交試驗（表1），獲得最佳提取方法。采用最佳方法，獲得其他生長時期的巨菌草葉片的提取液，供單寧含量測定。測定時，準確稱取0.5 g樣品，加入4 mL提取溶劑，在設(shè)定的溫度和時間下完成提取，轉(zhuǎn)移出所有提取液，定容到20 mL容量瓶，得到待測溶液。

1.2.3 單寧含量的測定 采用福林酚-比色法測定巨菌草中單寧的含量。標準曲線的制作：精密稱取干燥的單寧酸標準品25 mg，用水定容到50 mL容量瓶中，配制成單寧酸溶液。精密量取單寧酸溶液1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 mL分別置于25 mL容量瓶中，加水定容。精密量取各濃度溶液0.5 mL，分別置于10 mL試管中，先加入2.5 mL 10倍福林酚稀釋溶液，再加入2 mL 7.5%碳酸鈉溶液，搖勻，靜置30 min后，在760 nm處測定吸光度，并以吸光度為縱坐標，以質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線。

提取液單寧含量測定：精密量取0.5 mL待測溶液，按照標準曲線的試驗方法操作，在760 nm相同條件下測定吸光度，帶入回歸方程計算出巨菌草葉片中單寧質(zhì)量濃度，再按公式計算出總單寧含量。其計算公式為：單寧含量（mg/g）=提取液單寧質(zhì)量濃度×20/原料質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

每個試驗組設(shè)3個重復(fù)，按照正交試驗得出的最優(yōu)方法進行提取，提取液按照標準曲線的試驗方法操作，單寧含量測定結(jié)果采用ANOVA統(tǒng)計檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 單寧酸標準曲線和方程

以吸光度（y）為縱坐標，單寧酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，繪制單寧酸標準曲線，并得出其回歸方程和回歸系數(shù)（圖1）。回歸方程為：y=9.554 1x+0.028 6，回歸系數(shù)R2=0.997 9，線性范圍為0.02～0.22 mg/mL。

2.2 巨菌草單寧含量正交試驗結(jié)果

由正交試驗結(jié)果（表2）可知，因素A（丙酮體積分數(shù)）、因素B（提取溫度）和因素C（提取時間）的極差分別為2.70、2.28、0.60，因此可知，3因素對單寧含量的影響為丙酮體積分數(shù)略大于提取溫度，而二者遠大于提取時間。從表2還可以看出，因素A以三水平70%最佳，因素B以三水平50 ℃最佳，因素C以一水平1 h最佳。因此提取單寧的最佳提取方法是70%丙酮在50 ℃下提取1 h。

2.3 不同生長階段巨菌草單寧含量測定

由表3可知，巨菌草葉片單寧含量隨著生長時間呈上升趨勢，生長1、2、3個月的巨菌草葉片的單寧含量分別為8.47、10.44和12.59 mg/g。

3 討論

本研究通過正交試驗優(yōu)化了巨菌草單寧提取方法，與李學強等[11]對歐李種殼中單寧提取條件相比，各因素對單寧提取的影響程度均為丙酮體積分數(shù)>提取溫度>提取時間，對于最佳提取方法，歐李種殼中單寧是用70%丙酮在60 ℃下提取5 h，而本試驗是用70%丙酮在50 ℃下提取1 h，可以看出二者所用最佳丙酮體積分數(shù)一致；而提取溫度略有差異，考慮到丙酮的沸點為56.48 ℃，本研究的50 ℃更為合理；最佳提取時間與文獻相比存在差異，考慮到提取時間對得率影響不顯著，提取1 h更為經(jīng)濟。

研究測定得到巨菌草生長1、2、3個月時葉片的單寧含量分別為8.47、10.44和12.59 mg/g，高于黑麥草（0.9～1.8 mg/g）[12]、紅三葉（1.2 mg/g）[13]、菊苣（1.71 mg/g）[13]，與車前草（14.10 mg/g）[13]、苔草（6.7 mg/g）[14]相當，低于牛角花（46.20 mg/g）[13]、珠芽蓼（120.2 mg/g）[14]、紅豆草（13.42～34.48 mg/g）[15，16]、百脈根（20～110 mg/g）[17]?？傮w來說，巨菌草單寧含量與其他牧草相比處于中間水平。

單寧含量是影響牧草適口性的重要因素，當牧草干物質(zhì)中的單寧含量達到1%以上時，會出現(xiàn)苦澀味，降低適口性，當含量高于2%時可能會產(chǎn)生阻食作用[16-18]。對肉豬和禽類，飼料單寧含量以0.5%～1.0%為宜[18]；而對于反芻動物，其對單寧耐受性較高，有研究證實3%或5%以內(nèi)是有益水平[16，17]。巨菌草適口性好，可用于飼喂牛、羊、豬、兔、鵝、鴨等草食畜禽和草食性魚類。而在生產(chǎn)中一般巨菌草生長1個月較嫩的時候喂養(yǎng)豬、兔和鵝等畜禽，在生長2～3個月時喂養(yǎng)羊、牛等牲畜。本試驗證實巨菌草葉片單寧含量在1個月時為8.47 mg/g，即0.85%，較適合飼養(yǎng)肉豬和禽類，在生長2個月和3個月時分別為10.44和12.59 mg/g，即1.04%和1.26%，較適合飼養(yǎng)反芻動物，其變化規(guī)律和巨菌草在生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用相吻合。

參考文獻：

[1] 林興生，林占熺，林冬梅.不同種植年限的巨菌草對植物和昆蟲多樣性的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學報，2012，23（10）：2849-2854.

[2] 張進國，雷荷仙，黎紀鳳，等.巨菌草在不同海拔高度的生長表現(xiàn)[J].貴州農(nóng)業(yè)科學，2013（3）：112-115.

[3] 丁 銘，白 璐，王龍清.巨菌草引進試驗及栽培種植技術(shù)[J].農(nóng)村科技，2013（12）：62-63.

[4] 鄭金英，陳麗鳳，林占熺.菌草產(chǎn)業(yè)成長及其多功能性探析[J].中國農(nóng)學通報，2011，27（1）：304-308.

[5] 肖 正，趙 超，劉 斌.巨菌草高溫發(fā)酵產(chǎn)沼氣的初步研究[J].安徽農(nóng)學通報，2012，18（17）：18-21.

[6] 邱世海，韋立新，席春燕，等.生物質(zhì)發(fā)電廠燃料適用預(yù)處理技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀——以探討巨菌草的干燥預(yù)處理技術(shù)為例[J].輕工科技，2012（5）：102-104.

[7] 盧麒麟，唐麗榮，林雯怡，等.巨菌草制備納米纖維素及其表征[J].草業(yè)科學，2013，30（2）：301-305.

[8] 董曉娜，陳喜蓉，鐘劍鋒，等.巨菌草栽培靈芝試驗初探[J].熱帶林業(yè)，2013，41（1）：12-13.

[9] 崔紅標，梁家妮，周 靜，等.磷灰石和石灰聯(lián)合巨菌草對重金屬污染土壤的改良修復(fù)[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2013，32（7）： 1334-1340.

[10] 程 序，朱萬斌.北方農(nóng)牧交錯帶以開發(fā)能源作物促生態(tài)重建的前景[J].草業(yè)學報，2012，21（6）：1-7.

[11] 李學強，李秀珍，夢雨軒，等.歐李種殼中單寧提取條件的優(yōu)化[J].種子，2010（3）：9-12.

[12] OKOBOKI H K， NDLOVU L R， AYISI K K. Chemical and physical parameters of forage legume species introduced in the Capricorn region of Limpopo Province， South Africa[J]. South African Journal of Animal Science，2002，32（4）：247-255.

[13] JACKSON F S， BARRY T N， LASCANO C， PALMER B. The extractable and bound condensed tannin content of leaves from trop icaltree， shrub and forage legumes[J]. J Sci Food Agric， 1996，71：103-110.

[14] 郭彥軍，張德罡，龍瑞軍，等.高山灌木和牧草縮合單寧含量季節(jié)變化動態(tài)研究[J].四川草原，2004（6）：3-5

[15] 李素群，吳自立.紅豆草中單寧的分光光度法測定[J].草業(yè)學報，1993，2（2）：52-55.

[16] 牛菊蘭，馬文生.紅豆草中單寧對過瘤胃蛋白的保護研究[J].草業(yè)科學，1995，12（3）：60-62.

[17] BARRY N T， FORSS D A. The content of vegetative lotus condensed tannin pedunculatus， its regulation by fertiliser application， and effect upon protein solubility[J]. J Sci Food， 1983，34：1047-1056.

[18] 牛 鋒，趙宗蕃，徐繼芳，等.營養(yǎng)酸模中抗營養(yǎng)因子——單寧酸動態(tài)變化規(guī)律的對比試驗研究[J].中國草地，2002，24（3）： 46-51.