李 敏，葉絲蕊，邱棟梁

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002)

鴛鴦茉莉(Brunfelsia acuminate)又名雙色茉莉，為茄科(Solanaceae)鴛鴦茉莉?qū)俪＞G灌木，原產(chǎn)巴西?；ㄩ_(kāi)期間芳香四溢，花的顏色在開(kāi)后2－3 d內(nèi)從深紫色逐漸變?yōu)榘咨?，由于花開(kāi)有先后，在同株上能同時(shí)見(jiàn)到紫色和白色的花[1]，具有極高的觀賞價(jià)值。目前對(duì)鴛鴦茉莉的研究報(bào)道已有很多[1－3]，但對(duì)其在蛋白組方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)分離較為常用的方法，在蛋白質(zhì)組研究中應(yīng)用廣泛[4]。雙向電泳體系對(duì)不同材料的要求不同。在雙向電泳試驗(yàn)中，關(guān)鍵步驟的優(yōu)化是影響電泳圖譜質(zhì)量高低的主要因素。歐高政等[5]對(duì)雙向電泳技術(shù)在‘四季蜜’龍眼花芽上的應(yīng)用進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，獲得了較好的2-DE圖譜。朱小姝等[6]對(duì)蝴蝶蘭葉片進(jìn)行了雙向電泳關(guān)鍵步驟的優(yōu)化，也獲得了最佳應(yīng)用體系。本研究以鴛鴦茉莉花瓣為材料，利用酚抽提法優(yōu)化其蛋白質(zhì)雙向電泳體系，以期為進(jìn)一步研究鴛鴦茉莉蛋白質(zhì)組以及差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

鴛鴦茉莉花瓣采自福建農(nóng)林大學(xué)校園。花瓣采摘后立即用液氮速凍，并保存于－80℃冰箱中備用。

(1)蛋白提取液:100 mmol·L Tris-HCl(pH 8.0)+50 mmol·L 抗壞血酸+100 mmol·L KCl+50 mmol·L－1硼砂 +1%Triton-100+2% β-琉基乙醇 +0.7 mol·L－1蔗糖;(2)裂解液:7 mol·L－1尿素 +2 mol·L－1硫脲+2% 兩性電解質(zhì)載體+40 mmol·L－1DTT(現(xiàn)加)+4%CHAPS;(3)上樣水化液:7 mol·L－1尿素 +2 mol·L－1硫脲 +2%CHAPS+0.5%IPG Buffer+0.001% 溴酚藍(lán) +40 mmol·L－1DTT;(4)平衡液Ⅰ:50 mmol·L－1Tris-HCl(pH 8.8)+6 mol·L－1尿素 +30% 甘油 +2%SDS+1%DTT+0.002%溴酚藍(lán);(5)平衡液Ⅱ:50 mmol·L－1Tris-HCl(pH 8.8)+30% 甘油 +6 mol·L－1尿素 +2%SDS+2.5%碘乙酰胺+0.002%溴酚藍(lán);(6)考馬斯亮藍(lán)染色液:0.05%R250+10%乙酸+50%甲醇+40%ddH2O;(7)脫色液:30%甲醇+10%乙酸+60%ddH2O。

1.2 儀器與設(shè)備

Ettan IPG phorⅠ等點(diǎn)聚焦系統(tǒng)、EttanTMDALT SIX垂直板電泳系統(tǒng)、ImagescannerⅡ圖像掃描儀，均購(gòu)自GE Healthcare公司;高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自大連科瑞科技有限公司;水平搖床，購(gòu)自北京六一儀器廠;恒溫水浴鍋，購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司;旋渦混合器，購(gòu)自江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 樣品制備

采用酚抽法，參照文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行樣品制備。將6 g鴛鴦茉莉花瓣樣品在研缽中用液氮充分研磨成粉末，待液氮揮發(fā)完后，向研缽中加入18 mL蛋白提取液。待研缽中的提取液溶化后，繼續(xù)研磨，使花瓣粉末充分溶解在提取液中。將研缽中的提取液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，加入等體積Tris－飽和酚(pH 8.0)，使用旋渦混合器充分渦旋，使Tris－飽和酚與提取液混合均勻，4℃、5 500 g，離心10 min，取酚層至新的50 mL離心管中，再加入等體積酚提取液，渦旋混勻。4℃、5 500 g，離心10 min，取酚層至50 mL離心管中，加入6倍體積在－20℃下預(yù)冷的含0.1 mol·L－1乙酸銨的甲醇溶液，將離心管置于－20℃冰箱中過(guò)夜。次日將離心管取出，4℃、20 000 g離心20 min，倒掉上清液，用預(yù)冷的甲醇溶液沖洗離心管壁上的蛋白，使蛋白完全懸浮在甲醇溶液中，－20℃靜置1 h。4℃、20 000 g離心20 min，棄去離心管中的甲醇溶液，用含0.07% β-巰基乙醇的丙酮溶液沖洗沉淀，使沉淀懸浮在溶液中并放置在－20℃條件下靜置1 h。此步驟重復(fù)1次。4℃、20 000 g離心20 min，棄去上清液，然后用少量預(yù)冷的丙酮沖洗蛋白并分裝至1.5 mL離心管中，4℃、17 000 g離心15 min，棄去上清液，所得的蛋白沉淀在－20℃下真空干燥，干燥好的蛋白干粉迅速置于－80℃保存，備用。

1.4 蛋白的裂解與定量

取出約15 mg蛋白粉末，在離心管中加入300 μL蛋白裂解液，用超聲波震蕩20 min，待蛋白粉末完全溶解后，放入37℃水浴鍋中水浴2.5 h，其間每隔30 min渦旋1次。室溫、20 000 g離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，立即用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定和雙向電泳分析。

采用Bradford法[8]進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各樣品溶液的D595nm，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。依照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品的蛋白質(zhì)濃度，并用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 第一向等點(diǎn)聚焦

1.5.1 固相pH梯度膠條的水化 根據(jù)蛋白質(zhì)定量結(jié)果計(jì)算出所需的蛋白溶液體積，加入上樣水化液補(bǔ)足到450 μL后渦旋混勻，最終上樣總體積為450 μL。將蛋白樣品溶液均勻加入到膠條槽中，并把去掉保護(hù)膜的IPG干膠條放入膠條槽中。吸取800 μL礦物油將膠條表面均勻覆蓋，進(jìn)行第一向電泳。運(yùn)行條件為20℃，等電聚焦程序:200 V(1 h)－500 V(1 h)－1 000 V(1 h)－Gradient-8 000 V(0.5 h)－8 000 V(6 h)－1 000 V(2 h)，最大電流為50 mA。

1.5.2 膠條平衡 提前配制10 mL平衡液Ⅰ和10 mL平衡液Ⅱ。電聚焦完成后取出IPG膠條，將膠條置于干凈的濾紙上吸取膠條表面的礦物油，用電極緩沖液輕輕沖洗膠面，將膠條放入平衡液Ⅰ中平衡15 min之后轉(zhuǎn)入平衡液Ⅱ中平衡15 min，膠條要完全被平衡液覆蓋。2次平衡結(jié)束后，用鑷子將膠條取出，用電泳緩沖液沖洗膠條表面后轉(zhuǎn)移到SDS-PAGE凝膠上準(zhǔn)備第二向電泳。

1.6 SDS-PAGE 電泳

用12%SDS－PAGE凝膠配方提前配制好分離膠(表1)。將平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移到SDS分離膠，用低溶點(diǎn)瓊脂糖封膠，再加入高熔點(diǎn)瓊脂糖將膠條封好。瓊脂糖凝固后進(jìn)行SDS－PAGE電泳。室內(nèi)溫度控制在20℃左右，等到溴酚藍(lán)指示條帶將要到達(dá)凝膠底部邊緣時(shí)終止電泳。

與其他金屬材料成型工藝相比，以鋁薄板生產(chǎn)罐體所采用的減薄拉深工藝是非常復(fù)雜的成形操作.圖2為用減薄拉深工藝生產(chǎn)罐體的拉深過(guò)程的示意圖[34].鋁板材經(jīng)落料拉深后形成杯體，之后經(jīng)再次拉深及三次減薄，形成上端厚壁t1、中部薄壁t2、底部厚t3的罐體.依靠減薄罐體t1、t2的厚度，實(shí)現(xiàn)減薄用材厚度是固有的方法.厚度的減小使鋁罐成為薄壁件，薄壁件在加工過(guò)程中，因剛性差、強(qiáng)度低，在加工過(guò)程中受切削力、夾緊力、殘余應(yīng)力、切削熱等多種因素的影響，很容易產(chǎn)生加工變形，甚至報(bào)廢.

1.6.1 染色和脫色 電泳結(jié)束后，用考馬斯亮蘭染色法參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行染色。將膠條取出放入已過(guò)濾好的染色液中，放在水平搖床上輕搖2 h;染色結(jié)束后，將染色液倒掉或過(guò)濾回收，用蒸餾水將膠條清洗后再加入適量的脫色液脫色，期間多次更換脫色液直至背景清晰為止。

1.6.2 凝膠圖像掃描 脫色完成后，用ddH2O將凝膠上殘留的脫色液沖洗干凈，然后使用Images cannerⅡ圖像掃描儀進(jìn)行凝膠圖像掃描。掃描結(jié)束后取出凝膠，用保鮮膜密封，4℃下保存，備用。

表1 12%SDS-PAGE凝膠配制(360 mL)1)Table1 Components of 12%SDS-PAGE resolving gel solution(360 mL)

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)含量

利用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定，以牛血清蛋白的蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，每組D595nm的平均值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式以y=ax+b的形式表示，其中x為蛋白質(zhì)含量，y為D595nm值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式計(jì)算出鴛鴦茉莉花瓣蛋白質(zhì)濃度，優(yōu)化IPG膠條選擇及上樣量所用的濃度分別為 9.91 和 10.72 μg·mL－1。

圖1 Bradford法測(cè)定鴛鴦茉莉花瓣蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of protein content determined in B.acuminate petals by Bradford method

2.2 第一向IPG膠條的選擇

[9－10]，本研究分別使用pH值為3.0－5.6及4.0－7.0兩種膠條對(duì)第一向電泳膠條的選擇進(jìn)一步優(yōu)化。結(jié)果表明，參照文獻(xiàn)[9]，設(shè)置上樣量為1.3 mg的蛋白質(zhì)含量，不同pH膠條獲得的2-DE圖譜有明顯的區(qū)別(圖2)。采用24 cm、pH值為3.0－5.6得到的電泳圖譜分離效果較好，但得到的蛋白不全面(圖2A);采用24 cm、pH值為4.0－7.0的膠條獲得的2-DE圖譜蛋白質(zhì)分離效果雖不及前者，但能清晰地看到更多的蛋白質(zhì)點(diǎn)(圖2B)。綜上所述，鴛鴦茉莉花瓣蛋白在pH值為4.0－7.0膠條上得到的2-DE圖譜較為理想，鴛鴦茉莉花瓣大部分的蛋白也分布在此范圍內(nèi)。

圖2 鴛鴦茉莉花瓣總蛋白不同IPG膠條的2-DE圖譜Fig.2 Images of 2-DE in B.acuminate total proteins from different IPG strips

2.3 上樣量對(duì)2-DE圖譜的影響

選擇24 cm、pH值為4.0－7.0 IPG膠條，不同上樣量的2-DE圖譜見(jiàn)圖3。上樣量為1.3 mg時(shí)，2-DE圖譜上的蛋白點(diǎn)少且不清晰、分辨率低，會(huì)影響后期軟件分析(圖3A)。上樣量為1.5 mg時(shí)，2-DE圖譜蛋白點(diǎn)多且呈圓形或橢圓形，蛋白點(diǎn)分離效果與前者相比較好(圖3B)。因此，對(duì)于24 cm、pH值為4.0－7.0的IPG膠條，選用鴛鴦茉莉總蛋白上樣量為1.5 mg較為合適。

圖3 鴛鴦茉莉花瓣總蛋白不同上樣量的2-DE圖譜Fig.3 Images of 2-DE in B.acuminate total proteins from different loaded proteins

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，雙向電泳技術(shù)在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、植物等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，對(duì)果實(shí)、葉片等蛋白質(zhì)的研究報(bào)道越來(lái)越多，不同的材料、組織器官等都有不同的應(yīng)用體系[11]。雙向電泳分離技術(shù)試驗(yàn)過(guò)程受多種因素影響，只有進(jìn)行優(yōu)化才能獲得較好的試驗(yàn)結(jié)果。在進(jìn)行第一向等點(diǎn)聚焦電泳時(shí)，首先要選擇合適的IPG膠條，膠條長(zhǎng)度、pH范圍均會(huì)導(dǎo)致蛋白點(diǎn)分布不均勻、酸堿端不能有效分離，直接影響2-DE圖譜的質(zhì)量。Bar-akiva et al[10]采用pH值為3－10、13 cm的IPG膠條對(duì)鴛鴦茉莉花瓣進(jìn)行雙向電泳試驗(yàn)，蛋白點(diǎn)不多，分離效果不好。本研究采用了pH值為3.0－5.6、24 cm和pH值為4.0－7.0、24 cm兩種IPG膠條進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，其中，pH值為4.0－7.0的IPG膠條2-DE圖譜質(zhì)量相對(duì)較好。蛋白質(zhì)上樣量與膠條長(zhǎng)度密切相關(guān)。上樣量較大會(huì)使等點(diǎn)聚焦受到影響，電壓上升較慢，導(dǎo)致部分蛋白出現(xiàn)共遷移現(xiàn)象，即不同的蛋白質(zhì)出現(xiàn)在膠條的相同位置[6];上樣量較少會(huì)使蛋白點(diǎn)不清晰并且不利于軟件的檢測(cè)，且蛋白點(diǎn)的數(shù)量也隨著上樣量的減少而降低[12]。有些蛋白有可能在膠條上無(wú)法顯示，直接影響試驗(yàn)結(jié)果。

本試驗(yàn)表明，鴛鴦茉莉花瓣雙向電泳技術(shù)優(yōu)化最佳條件為:鴛鴦茉莉花瓣蛋白質(zhì)圖譜在24 cm、pH值為4.0－7.0的IPG膠條范圍內(nèi)，上樣量為1.5 mg，所得出的2-DE圖譜背景清晰、蛋白點(diǎn)明顯且拖尾較少，有利于后續(xù)的試驗(yàn)。

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