朱智德，羅宇東，劉源煥，李　娜

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠，廣西　南寧　530023）

耳草提取物的抑菌作用及急性毒性研究

朱智德，羅宇東，劉源煥，李娜

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠，廣西南寧530023）

［目的］研究耳草提取物的抑菌作用及急性毒性。［方法］運(yùn)用瓊脂平板結(jié)合試管二倍稀釋法觀察耳草提取物（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、乙醇、水提取物）對(duì)銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌等的抑制作用；急性毒性試驗(yàn)采用小鼠灌胃法，測(cè)定耳草水提取物、乙醇提取物的最大給藥量。［結(jié)果］體外抑菌試驗(yàn)表明，耳草水、乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌均有不同程度的抑制作用；系統(tǒng)溶劑提取物中，乙酸乙酯、正丁醇、甲醇提取物具有抑制大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌的作用，而氯仿、石油醚提取物抑菌作用不明顯。急性毒性試驗(yàn)表明耳草水提取物、乙醇提取物的最大給藥量為252.4 g/kg、336.6 g/kg。［結(jié)論］耳草提取物具有抑菌作用，水提取物及乙醇提取物的急性毒性很小。

耳草；提取物；抑菌作用；急性毒性

耳草為茜草科植物耳草Hedyotis hedyotidea（Dc.）Merr.的全草，別名較剪草、鯽魚膽草、細(xì)葉亞婆巢、節(jié)節(jié)花等，具有散瘀消腫、清熱解毒之效，對(duì)感冒發(fā)熱、咽喉痛、咳嗽、腸炎、痢疾、瘡癤和蛇咬傷均有較好的療效。耳草產(chǎn)于我國(guó)南部和西南部各省區(qū)，為廣西少數(shù)民族（壯瑤）地區(qū)民間廣泛使用的藥材。文獻(xiàn)報(bào)道耳草具有抗炎、鎮(zhèn)痛等作用［1-5］。本文對(duì)其抑菌作用及急性毒性進(jìn)行研究，為耳草的進(jìn)一步開發(fā)提供理論指導(dǎo)。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng)物昆明系小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級(jí)，合格證號(hào)：SCXK桂2014-0002。

1.2菌株、菌液銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）由南寧市第四人民醫(yī)院微生物室提供，金黃色葡萄球菌（Staphy lococcus aureus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、沙門菌（Salmonella）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，菌種批號(hào)分別為：26003-5a23-2、44102-3a14、50094-1a5。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：140819）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)，批號(hào)：140806）。菌液制備：挑取以上菌株的菌落，接種于肉湯培養(yǎng)管中，37℃培養(yǎng)24 h后，用生理鹽水稀釋為106CFU/ml的試驗(yàn)菌液備用。

1.3試藥耳草采自廣西上林縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定為茜草科耳草屬植物耳草Hedyotis hedyotidea （DC.）Merr.的干燥藤莖。

1.4主要試劑及儀器JY501電子天平（上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司）；101-1恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；RE501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；XFS-280壓力蒸汽滅菌器（浙江新豐醫(yī)療器械有限公司）；LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）。

2　方法與結(jié)果

2.1耳草提取物的制備

2.1.1耳草水提物（A）藥材粉碎，加水煎煮3次，每次1 h，過(guò)濾，濾液濃縮至浸膏（A），每克浸膏相當(dāng)于藥材量2.5 g，批號(hào)：20131201。

2.1.2耳草乙醇提取物（B） 耳草粉碎成細(xì)粉（100目），加入75%乙醇回流提取2次（每次8倍量，2 h），提取液抽濾，揮去乙醇，蒸干得浸膏（B），每克浸膏相當(dāng)于原藥材2.0 g，批號(hào)：20131202。

2.1.3耳草系統(tǒng)溶劑提取物（C～G）藥材粉碎（100目），按系統(tǒng)溶劑提取法分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇回流提取，提取液濾過(guò)，蒸干得稠膏。石油醚（G）、氯仿（F）、乙酸乙酯（E）、正丁醇（D）、甲醇（C）提取物相當(dāng)?shù)乃幉牧糠謩e為750，210，350，70，15 g/g（稠膏/藥材）。

上述提取物均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠制備，實(shí)驗(yàn)時(shí)配制成所需濃度。

2.2抑菌作用試驗(yàn)［6-9］取1 ml小試管若干支，將耳草不同溶劑提取物（A～G）分別按試管稀釋法等倍稀釋（1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，1/128），制備得系列濃度為90，45，22.5，11.3，5.6，2.8，1.4 mg/ml的供試液，每支試管中接種相應(yīng)的試驗(yàn)菌液各50 μl，混合均勻，置37℃培養(yǎng)24 h，然后再?gòu)拿恳恢г嚬苤腥?0 μl培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，均勻涂布，培養(yǎng)24 h（37℃），觀察各平板上細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，以此計(jì)算藥物的最小抑菌濃度（MIC）。藥物的最小抑菌濃度指不生長(zhǎng)菌落的最高藥物稀釋度。平行試驗(yàn)3次，以2次或者3次結(jié)果相同為有效。結(jié)果見表1、表2。

表1　耳草水、乙醇提取物對(duì)各菌株的MIC測(cè)定結(jié)果?。╩g/ml）

表2　耳草系統(tǒng)溶劑提取物對(duì)各菌株的MIC測(cè)定結(jié)果　（mg/ml）

由表1可見，耳草水提物對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌的MIC分別為2.8，5.6，45，45 mg/ml；耳草乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌的MIC分別為5.6，2.8，45，45 mg/ml?？梢姸菀掖?、水提取物對(duì)上述受試細(xì)菌有一定的抑制作用。

由表2可見，耳草不同極性溶劑的提取物中，甲醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌的MIC分別為5.6，2.8，11.3，11.3 mg/ml；正丁醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌的MIC分別為5.6，11.3，45，22.5 mg/ml；乙酸乙酯提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌的MIC分別為11.3，11.3，45，22.5 mg/ml；可見耳草的甲醇、正丁醇、乙酸乙酯提取物對(duì)上述受試細(xì)菌均有抑制作用。石油醚、氯仿提取物則對(duì)上述受試細(xì)菌無(wú)抑制效果。2.3耳草急性毒性試驗(yàn)［10-11］取60只小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，隨機(jī)分為3組，即空白對(duì)照組、耳草水提組、耳草醇提組，每組20只小鼠。小鼠禁飼（供水）20 h后，以耳草水提物最大濃度（2.5 g/ml）、醇提物最大濃度（3.7 g/ml）分別灌胃給予受試藥液，一天灌胃2次（上午8時(shí)和下午3時(shí)，給藥體積均為40 ml/kg，空白對(duì)照組灌胃等量飲用水，觀察給藥后14天內(nèi)小鼠的體重、外觀、行為、呼吸、四肢活動(dòng)、進(jìn)食、排泄、死亡等情況。14天后解剖小鼠，觀察組織臟器有無(wú)異常改變。

結(jié)果顯示，給藥后14天內(nèi)小鼠的外觀、行為、呼吸、四肢活動(dòng)、進(jìn)食、排泄等均未見明顯異常，無(wú)死亡現(xiàn)象；給藥組與空白對(duì)照組小鼠體質(zhì)量比較無(wú)顯著性差異。14天后解剖小鼠，觀察主要組織臟器，給藥組與空白對(duì)照組比較，動(dòng)物均無(wú)異常現(xiàn)象。測(cè)定耳草水提取物、乙醇提取物的最大給藥量為252.4 g/kg、336.6 g/kg，提示耳草的急性毒性很小。結(jié)果見表3。

表3　耳草對(duì)小鼠急性毒性試驗(yàn)體質(zhì)量的影響　（±s）

表3　耳草對(duì)小鼠急性毒性試驗(yàn)體質(zhì)量的影響?。ā纒）

組 別　n　給藥濃度（g/ml）　給藥量（ml/kg）　給藥前體質(zhì)量（g） 給藥14天體質(zhì)量（g）　增長(zhǎng)率（%）空白對(duì)照組　20　—　40　20.15±1.12　28.60±1.70　41.93耳草水提組　20　2.5　40　20.21±1.08　29.15±1.80　44.24耳草醇提組　20　3.7　40　20.05±1.06　29.50±2.05　47.13

3　討論

3.1耳草在兩廣地區(qū)廣泛應(yīng)用，是嶺南著名的抗炎鎮(zhèn)痛和傷科用藥。國(guó)內(nèi)對(duì)耳草的藥理研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，表明其具有抗炎鎮(zhèn)痛等作用，但對(duì)其抑菌作用及急性毒性研究方面的報(bào)道卻很少，為此本文開展了耳草抑菌作用及急性毒性試驗(yàn)研究。體外抑菌試驗(yàn)表明，耳草水、乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌均有不同程度的抑制作用；系統(tǒng)溶劑提取物中，乙酸乙酯、正丁醇、甲醇提取物具有抑制大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌的作用，而氯仿、石油醚提取物抑菌作用不明顯。急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，耳草水提取物、乙醇提取物的最大給藥量為252.4 g/kg、336.6 g/kg，提示耳草的毒性很低。

3.2國(guó)內(nèi)報(bào)道耳草含有β-谷甾醇、莨菪亭、表白樺脂酸、羽扁豆醇、齊墩果酸、咖啡酸、揮發(fā)油等成分［1-5］。本研究表明耳草提取物體外試驗(yàn)具有一定的抑菌效果，但考慮到中藥材的體內(nèi)及體外抑菌作用差別較大，耳草是否具有體內(nèi)抑菌作用還有待進(jìn)一步的研究。

［1］陶曙紅，陳艷芬，李鐘，等.耳草抗炎活性化學(xué)成分的研究［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，27（4）：364-366.

［2］陳艷芬，陶曙，余結(jié)貞，等.耳草抗炎鎮(zhèn)痛作用有效部位的篩選［J］.中藥新藥與臨床藥理，2012，23（1）：17-19.

［3］陶曙紅，張少逵，袁旭江.耳草葉揮發(fā)油化學(xué)成分的GCMS分析［J］.中成藥，2010，32（3）：511-512.

［4］禹建春，霍敏，方賀斌，等.耳草的鑒別研究［J］.海峽藥學(xué)，2012，24（11）：55-56.

［5］梁潔瑩，李書淵.耳草的生藥學(xué)研究［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，24（5）：447-448.

［6］陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：244.

［7］秦海宏，賈琳鈺，閻建義，等.鳳仙花水提物體外和體內(nèi)的抑菌活性［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013，39（1）：60-63.

［8］武新華，馬秀敏，丁劍冰，等.新疆赤芍抑菌實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2005，11（5）：30-31.

［9］張宏，甘雨，喬敏，等.射干提取物抑菌實(shí)驗(yàn)研究［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2012，29（2）：5-7.

［10］農(nóng)毅清，蔣林，吳玉強(qiáng)，等.常春衛(wèi)矛與爬行衛(wèi)矛的鎮(zhèn)痛抗炎作用及急性毒性研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23 （6）：1384-1385.

［11］周智，韋奇志，吳植強(qiáng)，等.扶芳藤一般藥理及急性毒性研究［J］.中國(guó)藥師，2011，14（8）：1115-1117.

（編輯陳明偉）

R285.5

A

2095-4441（2015）03-0052-03

2015-08-01

廣西衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項(xiàng)課題（編號(hào)：GZZY13-14）

朱智德，博士研究生，副教授，研究方向：藥品、食品研究開發(fā)

羅宇東，E-mail：1097201466@qq.com