周旭，翟延君

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600)

·基礎(chǔ)研究·

HPLC-ELSD同時(shí)測(cè)定柴胡消癭顆粒中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍藥苷、阿魏酸及橙皮苷的含量

周旭，翟延君*

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600)

目的：建立采用高效液相-蒸發(fā)光散射檢測(cè)(HPLC-ELSD)法同時(shí)測(cè)定柴胡消癭顆粒中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍藥苷、阿魏酸、橙皮苷的含量測(cè)定方法。方法：色譜柱為Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.01%甲酸水溶液，梯度洗脫；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為25 ℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器參數(shù)：漂移管溫度為60 ℃，霧化氣體為高純氮?dú)?，氮?dú)鈮毫?.0 MPa，Gain 6。結(jié)果：5種活性成分實(shí)現(xiàn)良好分離，柴胡皂苷a在0.21～1.64 μg線性關(guān)系良好，r=0.999 3，平均回收率為102.2%，RSD為1.5%；柴胡皂苷d在0.355～2.840 μg 線性關(guān)系良好，r=0.999 0，平均回收率為101.9%，RSD為1.5%；芍藥苷在1.20～9.60 μg線性關(guān)系良好，r=0.999 5，平均回收率為97.93%，RSD為2.2%；阿魏酸在0.140～1.120 μg線性關(guān)系良好，r=0.999 2，平均回收率為98.79%，RSD為2.7%；橙皮苷在1.00～8.00 μg線性關(guān)系良好，r=0.999 2，平均回收率為99.9%，RSD為2.6%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可為控制柴胡消癭顆粒的質(zhì)量提供參考。

柴胡消癭顆粒；柴胡皂苷a；柴胡皂苷d；芍藥苷；阿魏酸；橙皮苷；高效液相-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法

柴胡消癭顆粒為遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方，由柴胡、赤芍、當(dāng)歸、陳皮等8味中藥組成，方中以君藥柴胡作為肝經(jīng)引經(jīng)藥，疏肝解郁，使肝氣得以調(diào)達(dá)；以赤芍入肝經(jīng)血分，散瘀斂陰，柔肝止痛；以陳皮疏肝理氣，健脾和中。本復(fù)方氣血兼顧，肝脾同調(diào)，軟堅(jiān)散結(jié)，活血化瘀，共奏祛邪扶正、標(biāo)本兼治之功能。目前，柴胡消癭顆粒未有相關(guān)分析方法的文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)采用HPLC-ELSD，同時(shí)對(duì)君藥柴胡中有效成分柴胡皂苷a、柴胡皂苷d，赤芍中有效成分芍藥苷，當(dāng)歸中有效成分阿魏酸以及陳皮中有效成分橙皮苷進(jìn)行含量測(cè)定，能有效控制產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量，確保用藥安全，為完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；G1379A真空脫氣機(jī)、G1311A四元梯度泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1315A柱溫箱、Agilent1200 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，Agilent B04.03化學(xué)工作站(美國(guó)Agilent公司)；AE-240 電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；KH-400DB 超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；DK-98-Ι型電熱恒溫水浴箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試藥

柴胡皂苷a對(duì)照品、柴胡皂苷d對(duì)照品、芍藥苷對(duì)照品、阿魏酸對(duì)照品、橙皮苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110777-200507、110778-200506、110736-201136、0773-9910、110721-200211)；柴胡消癭顆粒由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)中心自制，規(guī)格為15 g/袋；甲醇(HPLC級(jí)，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)；水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.01%甲酸(B)梯度洗脫(0～10 min，15%→30%A；10～15 min，30%→40%A；15～18 min，40%→55%A；18～20 min，55%→60%A)；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為25 ℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，漂移管溫度為60 ℃，霧化氣體為高純氮?dú)?，氮?dú)鈮毫?.0 MPa，Gain 6，過(guò)濾器3 s。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取阿魏酸對(duì)照品適量，置容量瓶中，加入70%甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為0.140 mg·mL-1的溶液；取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍藥苷及橙皮苷對(duì)照品適量，分別置容量瓶中，加入甲醇定容，分別制成質(zhì)量濃度為0.205 mg·mL-1的柴胡皂苷a、0.355 mg·mL-1的柴胡皂苷d、1.20 mg·mL-1的芍藥苷、1.00 mg·mL-1的橙皮苷溶液。精密吸取上述5種對(duì)照品溶液，等比例混合，得混合對(duì)照品溶液，備用[1]。

2.3 供試品溶液制備

取柴胡消癭顆粒1袋，研細(xì)，取約10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入含5%氨水的甲醇溶液50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用含5%氨水的甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液25 mL，于50 ℃減壓蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得[2-4]。

2.4 陰性供試品溶液的制備

按處方及工藝制備成不含柴胡的顆粒劑，再按2.3項(xiàng)下方法制備成柴胡陰性供試品溶液，同法制成赤芍、當(dāng)歸及陳皮陰性供試品液，備用。

2.5 測(cè)定法

分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性供試品溶液各5 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。由色譜圖可知，供試品溶液在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上具有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性供試品溶液無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

A.混合對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.柴胡陰性供試品溶液；D.赤芍陰性供試品溶液；E.當(dāng)歸陰性供試品溶液；F.陳皮陰性供試品溶液；1.芍藥苷；2.阿魏酸；3.橙皮苷；4.柴胡皂苷a；5柴胡皂苷d。圖1 柴胡消癭顆粒HPLC圖

3 結(jié)果

3.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液5、10、20、30、40 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，進(jìn)樣量(μg)的常數(shù)對(duì)數(shù)值X與色譜峰面積的對(duì)數(shù)值Y經(jīng)線性回歸，得回歸方程：Y柴胡皂苷a=1.243X+9.779，r=0.999 3；Y柴胡皂苷d=1.110X+8.600，r=0.999 0；Y芍藥苷=0.941X+7.641，r=0.999 5；Y阿魏酸=1.437X+11.029，r=0.999 2；Y橙皮苷=0.977X+7.397，r=0.999 2。結(jié)果柴胡皂苷a在0.205～1.64 μg，柴胡皂苷d在0.355～2.84 μg，芍藥苷在1.20～9.60 μg，阿魏酸在0.14～1.21 μg，橙皮苷在1.00～8.00 μg線性關(guān)系良好。

3.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，

測(cè)定各成分的峰面積，分別計(jì)算其RSD值，結(jié)果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍藥苷、阿魏酸、橙皮苷峰面積常用對(duì)數(shù)的RSD分別為1.6%、2.1%、1.7%、2.6%和2.9%，表明儀器的精密度良好。

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取柴胡消癭顆粒(批號(hào)：20130301)，平行6份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各取5 μL進(jìn)樣，測(cè)定各成分峰面積，計(jì)算柴胡消癭顆粒中各待測(cè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和RSD。結(jié)果柴胡皂苷a的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.012 1 mg·g-1，RSD為2.8%；柴胡皂苷d的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.013 8 mg·g-1，RSD為3.1%；芍藥苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.250 mg·g-1，RSD為1.0%；阿魏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.017 0 mg·g-1，RSD為1.3%；橙皮苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.096 8 mg·g-1，RSD為1.9%，表明本法的重復(fù)性良好。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取柴胡消癭顆粒(批號(hào)：20130401)，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于供試品溶液制備后0、2、4、6、8 h，各取5 μL進(jìn)樣，測(cè)定各成分峰面積，結(jié)果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍藥苷、阿魏酸、橙皮苷峰面積的常用對(duì)數(shù)的RSD分別為3.6%、3.1%、1.8%、3.0%、3.1%，表明供試品溶液在室溫條件下放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.5 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知含量的柴胡消癭顆粒(批號(hào)：20130302)1.0 g，平行6份，分別精密加入柴胡皂苷a對(duì)照品溶液0.25 mL(質(zhì)量濃度為0.041 mg·mL-1)、柴胡皂苷d對(duì)照品溶液0.20 mL(質(zhì)量濃度為0.071 mg·mL-1)、芍藥苷對(duì)照品溶液1.00 mL(質(zhì)量濃度為0.240 mg·mL-1)、阿魏酸對(duì)照品溶液0.50 mL(質(zhì)量濃度為0.028 mg·mL-1)和橙皮苷對(duì)照品溶液0.45 mL(質(zhì)量濃度為0.200 mg·mL-1)，按2.3項(xiàng)下方法操作，進(jìn)行定量測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度良好。見(jiàn)表1。

3.6 樣品測(cè)定

按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法及2.1項(xiàng)下條件，對(duì)5批柴胡消癭顆粒進(jìn)行含量測(cè)定，以回歸方程計(jì)算各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表2 柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍藥苷、橙皮苷、阿魏酸的含量(n=5)

4 討論

4.1 檢測(cè)器的選擇

復(fù)方柴胡消癭顆粒中有效成分芍藥苷、阿魏酸、橙皮苷在紫外區(qū)有較強(qiáng)的吸收，而柴胡的有效成分柴胡皂a為齊墩果烷型三萜皂苷，分子結(jié)構(gòu)中僅有一個(gè)雙鍵，僅有較弱的末端吸收。應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定柴胡皂苷a、d含量的報(bào)道較多，檢測(cè)波長(zhǎng)多在210 nm左右。鑒于在利用紫外末端吸收處進(jìn)行定量分析檢測(cè)靈敏度低，基線容易發(fā)生漂移，嚴(yán)重影響含量測(cè)定的準(zhǔn)確性，故本試驗(yàn)采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，靈敏度高，基線平穩(wěn)，分離度好，能明顯減少雜質(zhì)峰的干擾，出峰時(shí)間短，便于操作[5]。

4.2 流動(dòng)相的選擇

柴胡消癭顆粒為復(fù)方制劑，方中成分復(fù)雜，干擾成分較多。通過(guò)文獻(xiàn)查閱[2-4，6-11]，筆者曾分別采用了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸、乙腈-醋酸、乙腈-磷酸等流動(dòng)相系統(tǒng)，分別按不同洗脫方法進(jìn)行洗脫。結(jié)果表明，采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸進(jìn)行梯度洗脫，5種有效成分中芍藥苷、橙皮苷峰拖尾較嚴(yán)重，柴胡皂苷不易被洗脫；采用乙腈-醋酸進(jìn)行梯度洗脫保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，故筆者選擇以乙腈-0.01%甲酸水梯度洗脫，使各色譜峰有效改善拖尾現(xiàn)象，且能達(dá)到較快、較好分離。

4.3 提取方法的選擇

柴胡消癭顆粒中君藥柴胡有效成分柴胡皂苷a含量較低，在酸性條件下，柴胡皂苷a分子結(jié)構(gòu)中的環(huán)氧醚鍵會(huì)開環(huán)，轉(zhuǎn)化為具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的柴胡皂苷b1，所以使用弱堿性溶劑提取柴胡皂苷a[12]。試驗(yàn)中分別以甲醇、5%吡啶甲醇、5%氨水甲醇作為提取溶劑，進(jìn)行超聲提取的方法考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5%氨水甲醇提取效果最佳；考察了不同提取時(shí)間(20、30、40 min)樣品中柴胡皂苷a的含量，結(jié)果在30～40 min樣品中柴胡皂苷a的含量基本不變；考察了不同溫度下(45、55、65、75、85 ℃)，2 h內(nèi)柴胡皂苷a含量的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 h內(nèi)，在45～55 ℃柴胡皂苷a的含量變化最小[13]。故本試驗(yàn)選用5%氨水甲醇溶液超聲30 min，50 ℃回收溶劑的提取方法。

4.4本試驗(yàn)采用HPLC-ELSD同時(shí)測(cè)定藥材中5種有效成分的含量，方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果可靠，可為更好地控制該復(fù)方制劑提供依據(jù)。

4.5由于阿魏酸是弱有機(jī)酸，曾有文獻(xiàn)報(bào)道其化學(xué)穩(wěn)定性不高，水溶液藥物有效期不到2年，見(jiàn)光時(shí)分解更快[14]。從測(cè)定結(jié)果看，不同批次柴胡消癭顆粒樣品中，當(dāng)歸有效成分阿魏酸的含量差別較大，這是否與該制劑貯藏情況有關(guān)，有待于進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

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SimultaneousDeterminationofSaikosaponina、Saikosaponind、Paeoniflorin、FerulicAcidandHesperidininChaihuXiaoyingGranulesbyHPLC-ELSD

ZHOUXu，ZHAIYanjun1*

(LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian，Liaoning116600，China)

Objective：To establish an HPLC-ELSD method for simultaneous determination of saikosaponin a、saikosaponin d、paeoniflorin、ferulic acid and hesperidin in Chaihu Xiaoying Granules.Methods：The chromatographic separation was performed on Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)column.The mobile phase was acetonitrile-0.1% formic acid in gradient elution.The flow rate was 1.0 mL·min-1and column temperature maintained at 25 ℃.Evaporative light scattering detector was used.The drift tube temperature was 60 ℃.The N2gas flow was 3.0 MPa，Gain 6.Results：The five constituents were separated well.The linear range of saikosaponin a was 0.21-1.64 μg，r=0.999 3，average recovery was 102.2%，RSD 1.5%。The linear range of saikosaponin d was 0.355-2.84 μg，r=0.999 0，average recovery was 101.9%，RSD1.5%。The linear range of paeoniflorin was 1.20-9.60 μg，r=0.999 5，average recovery was 97.93%，RSD2.2%。The linear range of ferulic acid was 0.140-1.12 μg，r=0.999 2，average recovery was 98.79%，RSD2.7%。The linear range of hesperidin was1.00-8.00 μg，r=0.999 2，average recovery was 99.9%，RSD2.6%.Conclusion：The method is rapid，simple and accurate，and can be used for quality control of Chaihu Xiaoying Granules.

Chaihu Xiaoying Granules；saikosaponin a；saikosaponin d；paeoniflorin；ferulic acid；hesperidin；HPLC-ELSD

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.3.009

2014-10-27)

*

翟延君，博士，教授，研究方向：中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)；E-mail:lnzyzj@sohu.com