陸建美，閆鴻麗，王艷芳，胡雪巖，俞捷，尚云青

(云南中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，云南 昆明 650500)

·基礎(chǔ)研究·

滇黃精及其活性成分群對α-糖苷酶活性抑制作用研究△

陸建美，閆鴻麗，王艷芳，胡雪巖，俞捷*，尚云青*

(云南中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，云南 昆明 650500)

目的：探討滇黃精及其活性成分群對α-葡萄糖苷酶活性的抑制。方法：以4-硝基酚α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)為底物，研究滇黃精不同提取成分對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。結(jié)果：滇黃精及其不同提取物對α-葡萄糖苷酶都具有一定的抑制作用，其中小劑量的滇黃精總皂苷抑制率最明顯，抑制率為34.2%；滇黃精生水提液次之，抑制率為27.7%；而其制水提液及其總多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用不明顯。結(jié)論：滇黃精總皂苷具有明顯的α-葡萄糖苷酶抑制活性，可能為滇黃精降糖活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

滇黃精；總皂苷；α-葡萄糖苷酶

黃精是我國重要的藥食兩用資源，《中華人民共和國藥典》2010版收載黃精為百合科植物滇黃精PolygonatumkingianumColl.Et Hemsl.、黃精PolygonatumsibiricumRed.或多花黃精PolygonatumcyrtonemaHua的干燥根莖。分別習(xí)稱“大黃精”“雞頭黃精”“姜形黃精”?！吨腥A人民共和國藥典》規(guī)定的三個黃精中，滇黃精產(chǎn)量大，市場份額大，主產(chǎn)于云南、四川、貴州、廣西等省。云南為滇黃精的道地產(chǎn)地[1]，蘊(yùn)藏量大，品質(zhì)優(yōu)良?！兜崮媳静荨贰对颇现参镏尽返染械狳S精藥用記載，其為重要的“云藥”品種之一，具有廣泛的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)及良好的開發(fā)前景。

黃精主要含有多糖、低聚糖、黃精皂苷、氨基酸、黃酮及微量元素等成分，有抗衰老、增強(qiáng)免疫力、降血糖、降血脂、抗菌、抗病毒等作用，臨床上主要用于降血糖。據(jù)報(bào)道，滇黃精提取物對多種原因?qū)е碌母哐切∈笥薪堤亲饔肹2]。黃精多糖能夠降低腎上腺素誘發(fā)的高血糖小鼠的血糖值，同時能降低腎上腺素模型小鼠肝臟中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的含量[3]；黃精甲醇提取物在降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的高血糖小鼠血糖的同時不改變胰島素水平，還有抑制腎上腺素誘發(fā)高血糖小鼠血糖的作用[4]。

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)是一類能夠從含有α-葡萄糖苷鍵底物的非還原端催化水解α-葡萄糖基的酶，包括位于小腸腔的α-淀粉酶、小腸上段刷狀緣的麥芽糖酶、α-糊精酶和蔗糖酶等。食物中的碳水化合物經(jīng)相關(guān)酶作用后和蔗糖一起，通過蔗糖酶等α-糖苷酶水解作用生成葡萄糖、半乳糖和果糖，經(jīng)腸壁細(xì)胞吸收而被機(jī)體利用。α-葡萄糖苷酶與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展及機(jī)體糖代謝紊亂密切相關(guān)[5]。德國拜耳公司于20世紀(jì)70年代研制的α-葡萄糖苷酶抑制劑，主要通過抑制α-葡萄糖苷酶活性，從而降低餐后的血糖水平?？诜?葡萄糖苷酶抑制劑后，小腸上段的糖苷酶活性大部分被抑制，寡糖和雙糖的吸收減慢，有的可減少80%。此類藥物對Ⅰ、Ⅱ型糖尿病均適用，也可以與其他口服降糖藥或胰島素聯(lián)合使用。目前市場上銷售的用于治療糖尿病的α-葡萄糖苷酶抑制劑有阿卡波糖(拜糖平)、伏格列波糖(倍欣)、米格列醇。經(jīng)臨床應(yīng)用，上述藥物均取得了較好的療效，被認(rèn)為是Ⅱ型糖尿病的首選藥和Ⅰ型糖尿病胰島素治療的輔助藥物[6]。

滇黃精具有良好的調(diào)節(jié)糖代謝活性功能，已在臨床上廣泛應(yīng)用。目前對滇黃精降糖活性成分及作用靶點(diǎn)的研究較少，且其降糖的活性成分及作用機(jī)理均不明確，缺乏對除滇黃精多糖外其余成分類群的活性研究，其質(zhì)量控制方法也不完善，只根據(jù)總多糖含量難以評價滇黃精質(zhì)量。為此，本研究從滇黃精不同提取物對α-葡萄糖苷酶的作用情況入手，探討和比較其活性成分群的α-葡萄糖苷酶抑制作用，篩選出滇黃精降血糖的主要活性物質(zhì)，為其降糖機(jī)制的后續(xù)研究提供參考。

1 方法

1.l 儀器與試藥

1.1.1 儀器 UV-2100型分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；CP225D型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.1.2 試藥α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)；4-硝基酚α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG，批號：101324963，CAS：3767-28-0)；阿卡波糖(拜耳醫(yī)藥保健有限公司)；胎牛血清(批號：NXA0544)；其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 試劑配制

酶溶液：精密稱取1.002 1 gα-葡萄糖苷酶凍干粉，用0.1 mol·L-1PBS溶液溶解，加入0.2 mL的胎牛血清，再用0.1 mol·L-1PBS定容到100 mL，配成濃度為0.15 U·mL-1的溶液。

pNPG：用0.1 mol·L-1PBS溶液將pNPG粉末溶解，配制成濃度為20 mmol·L的溶液。

阿卡波糖：取2片(50 mg/片)阿卡波糖研碎，溶于1 mL PBS溶液中，5000 rpm離心2 min，取上清液，得質(zhì)量濃度為100 mg·mL-1的溶液。

1.3 滇黃精的炮制及活性成分群的制備

1.3.1 炮制方法 依據(jù)《中華人民共和國藥典》2010版記載，將鮮滇黃精洗凈，切成厚片，置蒸制器內(nèi)，蒸至黃精片成滋潤黑色，烘干，即得蒸制滇黃精。

1.3.2 水提液的制備 將滇黃精粉碎，加入20倍量的水，分2次提取，每次1.5 h，濃縮到適當(dāng)濃度，即得滇黃精水提液。

1.3.3總皂苷的提取 將滇黃精粉碎，用10倍量的80%乙醇水浴提取1.5 h，提取2次，減壓回收乙醇，得浸膏，分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，最后回收正丁醇，得浸膏，揮干正丁醇，冷凍干燥后即得總皂苷。

1.3.4 黃精多糖的提取 將滇黃精粗粉分別用8倍量和6倍量蒸餾水提取，合并濾液，減壓濃縮得浸膏(每mL含1 g生藥)，用4倍量的無水乙醇沉淀后，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，用sevage法去蛋白，透析，冷凍干燥，即得較純的多糖。

1.4 反應(yīng)體系優(yōu)化

在磷酸鉀緩沖液(pH 6.8)體系中，反應(yīng)溫度為37 ℃，以pNPG為反應(yīng)底物，加入葡萄糖苷酶，以碳酸鈉(Na2CO3)為終止液。pNPG溶液無色，但經(jīng)葡萄糖苷酶水解，釋放出對硝基苯酚(pNP)，pNP在堿性條件下呈黃綠色，在400 nm處有最大吸收。當(dāng)加入α-糖苷酶抑制劑時，可以抑制α-糖苷酶的活性，減少pNP的釋放，因此可以通過吸光度的變化來測定抑制活性。調(diào)整α-糖苷酶和底物pNPG的濃度，糖苷酶濃度固定后，當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾佣舛戎禑o明顯變化時，確定其為最佳反應(yīng)體系。

1.5 陽性對照藥物最大抑制濃度的確定

取不同體積的阿卡波糖溶液，加人到反應(yīng)體系中，空白對照組加入相同體積的PBS溶液(濃度為0.1 mol·L-1)，其他方法同酶活力測定，確定阿卡波糖對α-糖苷酶的最大抑制濃度及抑制率。

1.6 酶活力單位定義及抑制率計(jì)算

酶活力單位：37 ℃、pH 6.8條件下，每分鐘水解底物所產(chǎn)生1 mol pNP的酶量，規(guī)定為一個酶活力單位(U)。

酶抑制活力單位：在相同條件下降低1個酶活力單位所需的抑制劑的量為一個抑制劑活力。

抑制率=(抑制劑活力/原酶活力)×100%

簡化公式：抑制率=(A空白-A樣品)/A空白×100%

(A空白為未加樣品體系的吸光度，A樣品為加入樣品體系的吸光度)

2 結(jié)果

2.1 最佳反應(yīng)體系的確定

確定反應(yīng)體系中酶的量后，隨著pNPG體積的增加，pNP的釋放隨之增加到最高值，確定其為酶與pNPG的最佳反應(yīng)體系。見圖1。

最終反應(yīng)體系確定：取pH 6.8磷酸鹽緩沖液725 μL，待測樣品溶液10 μL，α-葡萄糖苷酶(0.15 U·mL-1)100 μL，混勻，不加待測樣品溶液作為空白對照(pH 6.8磷酸鹽緩沖液補(bǔ)足)，以不加酶溶液的反應(yīng)體系作為溶劑系統(tǒng)調(diào)零，37 ℃恒溫水浴保溫10 min，再向反應(yīng)體系中加入175 μL 4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷，恒溫10 min后，立即加入2 mL濃度為0.1 mol·L-1的Na2CO3溶液終止反應(yīng)。

2.2 陽性藥的最大抑制率

反應(yīng)體系確定酶濃度以后，加入的阿卡波糖在體系中的質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1時，抑制率為63.6%，當(dāng)加入的阿卡波糖質(zhì)量濃度大于0.5 mg·mL-1時，抑制作用無明顯增加。因此，當(dāng)阿卡波糖的質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1時具有最大抑制率，作為陽性對照藥物的最佳濃度。結(jié)果見圖2。

圖1 pNPG體積-吸光度曲線

圖2 阿卡波糖濃度-抑制率曲線

2.3 滇黃精水提液及其不同組分對α-葡萄糖苷酶的抑制率作用

與制滇黃精作用相比，生滇黃精水提液對α-葡萄糖苷酶有明顯的抑制作用，抑制率為27.7%，隨著濃度的增加，制滇黃精水提液作用反而有所下降，見表1。此外，活性成分群總皂苷有明顯的抑制作用，濃度較小(質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1)的滇黃精總皂苷抑制率為34.2%，見表2，黃精多糖抑制作用較弱，見表3。

表1 滇黃精水提液的α-葡萄糖苷酶抑制率(x±SD)

表2 滇黃精總皂苷的α-葡萄糖苷酶抑制率(x±SD)

表3 滇黃精總多糖的α-葡萄糖苷酶抑制率(x±SD)

3 討論

研究結(jié)果顯示，滇黃精及其不同提取物對α-糖苷酶都有一定的抑制作用，這與滇黃精具有降血糖的功能相符。相對于其他組分，滇黃精總皂苷的抑制作用更明顯，且成量效關(guān)系，質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1時總皂苷有明顯的抑制作用。因此，黃精總皂苷可能通過參與抑制體內(nèi)小腸α-糖苷酶的作用而具有降低血糖的作用，其可作為黃精抑制α-糖苷酶的主要成分進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)研究。

可作為α-糖苷酶抑制劑的藥物主要源于微生物發(fā)酵液、天然植物提取以及人工化學(xué)合成的有機(jī)物[8]，目前已用于臨床的α-糖苷酶抑制劑類藥物主要有排氣增加、腹瀉、腸鳴、腹痛等副作用[9]，還有丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)升高以及導(dǎo)致肝腎損傷等報(bào)道[10]。而從天然植物中尋找新的具有更低毒副作用、高效的α-糖苷酶抑制劑一直是各國研究的熱點(diǎn)。

基于滇黃精總皂苷體外抑制α-糖苷酶的作用，以及滇黃精作為藥食兩用且無毒副作用，從滇黃精中提取的總皂苷可作為黃精降糖作用的主要成分，并且需要進(jìn)一步研究其體內(nèi)降糖機(jī)制。

[1] 陳興榮，王成軍，楊永壽.滇黃精抗衰老保健食品的研究與開發(fā)[J].中國民族民間醫(yī)藥，2009(21)：1-3.

[2] 陳興榮，賴泳，王成軍.滇黃精對誘導(dǎo)性高血糖小鼠血糖影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21(12)：3163-3164.

[3] 王紅玲，張渝侯，洪艷，等.黃精多糖對小鼠血糖水平的影響及機(jī)理初探[J].兒科藥學(xué)雜志，2002，8(1)：14-15.

[4] Kato A，Miura T.Hypoglycemic activity of Polygonati Rhizoma in nomal and diabetic mice[J].Biol Pham Bull，1993，16(11)：18-20.

[5] Horii S，F(xiàn)ukase H.Synthesis ofα-glucosidase inhibitiory activity of N-substituted valiolsmine derivatives as potential oral antidiabetic agents[J].J Med Chem，1986，29(6)：1038-1046.

[6] 劉霞，馮長根.酶抑制劑在抗糖尿病藥物中的應(yīng)是研究[J].中國藥學(xué)雜志，2003，38(2)：89-91.

[7] Matsui T，Shimada M，Saito N.α-Glucosidase inhibition assay in an enzyme-immobilized amino-micrioplate[J].Anal Sci，2009，25(4)：559-562.

[8] Asano N.Glycosidase inhibition：update and perspectives on practical use[J].Glycobio，2003：13(10)：93-104.

[9] Holman R，Cull C A，Turner R C.A randomized double-blind trial of acarbose in type 2 diabetes shows improved glycemie control over 3 years(U.K.Prospective Diabetes Study 44)[J].Diabetes Care，2004，68(11)：2239-2246.

[10] Van de Laar F A，Lucassen P L，Akkermans R P.Alpha-glucosidase inhibitors for patients with type 2 diabetes results from a Cochrane systematic review and meta-analysis[J].Diabetes Care，2005，28(1)：154-63.

InhibitoryEffectofPolygonatumkingianumRhizomaanditsActiveIngredientGroupsonα-Glucosidase

LUJianmei，YANHongli，WANGYanfang，HUXueyan，YUJie*，SHANGYunqing*

(FacultyofPharmaceuticalScience，YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Kunming，650500，YunnanProvince，China)

Objective：To study the inhibitory effect ofPolygonatumkingianumrhizomes and its active ingredient groups on theα-glucosidase.Methods：Invitroα-glucosidase inhibition rate was tested by using 4-nitrophenol-α-D-glucopyranoside(pNPG)as substrate.Results：The inhibition rate of low dose total saponin was 34.2%，and that ofP.kingianumrhizomes water extraction was 27.7%.However，no inhibitory effect was found in total polysaccharide group.Moreover，the inhibition effect vanished after the crude drug was processed.Conclusion：Total saponin might be one of the active substances ofPolygonatumrhizomato reduce blood sugar.

Polygonatumkingianum；total saponin；α-glucosidase

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.3.003

2014-08-28)

云南省教育廳自然科學(xué)研究基金(2014J067)；云南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目基金(31070101814)

*

俞捷，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥理學(xué)和藥物分析學(xué)；Tel：(86-871)5918055，E-mail：cz.yujie@gmail.com 尚云青，副教授，研究方向：食品藥品科學(xué)；Tel：(86-871)5918033，E-mail：shyq86@sina.com