陶義存，董翔，許永華，靳春麗，屠鵬飛

(1.新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011；3.北京大學 藥學院，北京 100191)

·基礎研究·

肉蓯蓉苯乙醇總苷對高原腦水腫大鼠水通道蛋白4的影響△

陶義存1，董翔2，許永華2，靳春麗1，屠鵬飛3*

(1.新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011；3.北京大學 藥學院，北京 100191)

目的：觀察肉蓯蓉苯乙醇總苷預防給藥對高原腦水腫模型大鼠的作用。方法：大鼠隨機分為正常對照組、模型組、大花紅景天口服液組(1.78 mL·kg-1·d-1)，肉蓯蓉苯乙醇總苷低、中、高劑量組(75、150、300 mg·kg-1·d-1)，每組12只，灌胃預防給藥10 d，第8天起除正常對照組外其余各組置于模擬海拔5000 m高原環(huán)境72 h建立高原腦水腫模型，觀察各組大鼠腦組織病理改變，檢測腦組織干濕比、腦組織水通道蛋白4(aquaporin-4，AQP4)的表達變化。結果：與正常對照組(腦組織干濕比為：4.65±0.10)相比，模型組大鼠腦組織干濕比(5.14±0.16)顯著升高，腦組織AQP4表達增加(模型組表達為正常組的2.21±0.46倍)。肉蓯蓉苯乙醇苷能夠降低腦組織含水量(低中高劑量組依次為：4.68±0.08，4.66±0.10，4.66±0.18)，且能降低高原腦水腫大鼠腦組織水通道4mRNA(低中高劑量組依次為正常組的：1.20±0.30，1.03±0.17，1.12±0.33倍)和蛋白的表達，改善高原腦水腫大鼠腦水腫病理改變。結論：肉蓯蓉苯乙醇苷能夠預防高原腦水腫的發(fā)生，可能與其抑制水通道4的表達有關。

管花肉蓯蓉；苯乙醇總苷；高原腦水腫；水通道蛋白4

高原腦水腫(high-altitude cerebral edema，HACE)一般發(fā)生在初次進入海拔超過3000 m高原環(huán)境時，由于機體對高原低壓低氧環(huán)境的不適應而導致的一種嚴重威脅生命的疾病，它與高原反應、高原肺水腫是急性高原病的3種表現(xiàn)形式[1]。盡管關于高原腦水腫的研究相比高原肺水腫較少，但相關研究表明水通道4蛋白表達的增多，從而增加血腦屏障通透性，參與腦水腫形成和發(fā)展，在高原腦水腫的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用[2-3]。

管花肉蓯蓉Cistanchetubulosa(Schenk)R.Wight為中藥肉蓯蓉的基源植物之一，具有補腎陽、益精血、潤腸通便之功效。化學成分研究表明，肉蓯蓉主要含苯乙醇苷類(phenylethanoid glycosides)、環(huán)烯醚萜及其苷類(iridoids and iridoid glycosides)、木脂素及其苷類(lignans and lignan glycosides)、寡糖酯類(oligosaccharide esters)、多糖類(polysaccharides)等成分，其中松果菊苷、毛蕊花糖苷等苯乙醇苷類為其主要藥效成分[4]。多年來對肉蓯蓉苯乙醇苷的藥理研究表明其具有抗缺氧、抗輻射、清除自由基等作用[5-7]，與抗高原病有效成分紅景天苷具有相似的藥理作用。為了解肉蓯蓉苯乙醇苷類是否具有抗高原腦水腫作用，本研究利用西北地區(qū)特殊環(huán)境人工實驗艙建立大鼠高原腦水腫模型[8-9]，對管花肉蓯蓉苯乙醇總苷(phenylethanoid glycosides fromCistanchetubulosa，簡稱PhGs-Ct)對高原腦水腫的預防作用及其可能的作用機制進行了研究，以期為肉蓯蓉臨床新用途的拓展提供科學依據。

1 材料

1.1 動物

實驗動物Wistar大鼠，SPF級，雌雄各半，體重180～220 g，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，動物生產許可證號SCXK(新)2011-0004，動物使用許可證號為SYXK(新)2011-0004。實驗設計通過了新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理學審核，符合實驗動物倫理學要求。

1.2 動物飼養(yǎng)條件

前7天，各組動物飼養(yǎng)在SPF環(huán)境實驗室。后3天，正常對照組仍飼養(yǎng)在SPF環(huán)境，其余各組飼養(yǎng)在海拔5000 m低氧環(huán)境(大氣壓為54.1 Kpa，氧分壓為11.52 Kpa)。SPF環(huán)境如下：

溫度：22～26 ℃；

相對濕度：40%～70%；

光照條件：12 h/12 h明暗交替；

通風情況：全新風；

動物房的一般清潔消毒：0.2%新潔爾滅拖擦清洗。

1.3 儀器

西北特殊環(huán)境人工實驗艙(蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院，DY-2)，光學顯微鏡(日本Nikon公司，E200)，組織切片機(德國美康公司，HM340E)，電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，AL204，精度0.1 mg)，化學發(fā)光成像系統(tǒng)(上海勤翔科學儀器有限公司，Chemiscope 3000)，凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司，Bio Doc Imaging)實時定量PCR儀(美國ABI公司，7500 Fast)。

1.4 藥品與試劑

管花肉蓯蓉苯乙醇總苷(北京大學屠鵬飛教授提供，含量90.70%，用蒸餾水配制成相應濃度的溶液)；大花紅景天口服液(西藏藏藥集團股份有限公司，120503，國藥準字B20070002，10 mL*12支)；免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，SP-9000)，AQP4抗體(Santa Cruz Biotechnology，L9057)。

2 方法

2.1 分組與用藥

Wistar大鼠隨機分為6組：正常對照組，模型組，大花紅景天口服液組(1.78 mL·kg-1·d-1)，PhGs-Ct低劑量組(75 mg·kg-1·d-1)、PhGs-Ct中劑量組(150 mg·kg-1·d-1)、PhGs-Ct高劑量組(300 mg·kg-1·d-1)，每組12只。各組均在SPF環(huán)境飼養(yǎng)，正常對照組、模型組灌胃蒸餾水，其余各組按照相應劑量灌胃給藥，連續(xù)給藥10 d，7 d后除空白對照組外其余各組置于模擬海拔5000 m高原環(huán)境的人工實驗艙中飼養(yǎng)。艙內高度以10 m·s-1的速度勻速上升到海拔5000 m水平(大氣壓為54.1 Kpa，氧分壓為11.52 Kpa)，其間動物自由進水及進食，每24 h開艙半小時給藥，添加飼料及飲水[10]。

2.2 動物處理

各組大鼠出倉后立即腹腔注射戊巴比妥鈉(2%，2.0 mL·kg-1)麻醉，腹主動脈取血，打開顱腔，取腦組織，取左腦上半部稱重后錫箔紙包裹測定組織濕干比，左腦下半部4%多聚甲醛固定，用于HE染色及AQP4免疫組化。右腦-80 ℃冰箱凍存，用于測定AQP4 mRNA的表達。

2.3 腦組織病理學觀察

腦組織放入4%的多聚甲醛中充分固定后，脫水、包埋、切片、HE染色，不同放大倍數(shù)光學顯微鏡下觀察病理改變，并拍攝圖片。

2.4 腦組織濕干比

取左腦上半部稱重后，錫箔紙包裹腦組織，置烘箱(80 ℃，72 h)干燥至恒重，稱干重量，計算濕干比：濕干比=干燥前組織重量/干燥后組織重量。

2.5 免疫組化測定AQP4的表達

采用親合素-生物素復合物(Avidin Biotin Complex，ABC)染色，二氨基聯(lián)苯胺顯色法。

免疫組化步驟如下：切片，烤片、脫蠟、水化，組織抗原修復，淬滅內源性過氧化物酶活性，封閉，加入一抗，加入二抗，滴加試劑ABC，DAB顯色，復染、分化、透明，封片。

2.6 AQP4 mRNA表達的測定

提取腦組織總RNA，DNase I消化樣品RNA中的DNA，進行RNA瓊脂糖凝膠電泳，將RNA反轉錄為cDNA，進行cDNA檢測。

AQP4熒光實時定量PCR引物由上海生工有限公司合成，見下表。

基因名序列β-actinF:5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3'R:5'-ATGTCACGCACGATTTCCC-3'AQP4F:5'-TTGGACCAATCATAGGCGC-3'R:5'-GGTCAATGTCGATCACATGC-3'

2.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行分析，計量數(shù)據均采用均數(shù)±標準差表示，數(shù)據先進行正態(tài)性檢驗，符合組間比較采用獨立樣本t檢驗，不符合進行對數(shù)轉換。檢驗水準為α=0.05。

3 結果

3.1PhGs-Ct對高原腦水腫大鼠腦組織病理改變的影響

在光鏡下觀察各組大鼠腦組織病理切片可見，正常對照組腦組織分子層、外顆粒細胞層、椎體層細胞層、內顆粒細胞層、多行細胞層結構清楚，未發(fā)現(xiàn)病變。模型組大鼠腦組織毛細血管充血、水腫，分子層、椎體層細胞水腫明顯。PhGs-Ct低劑量組大鼠腦組織分子層部分血管擴張充血水腫，細胞輕度水腫，水腫較模型組減輕。PhGs-Ct中劑量組大鼠腦組織部分腦膜下血管擴張充血，偶見細胞水腫，水腫較模型組明顯減輕。PhGs-Ct高劑量組分子層無明顯水腫，血管周圍輕度水腫，水腫較模型組明顯減輕。大花紅景天組大鼠腦組織分子層散在水腫，散在血管極輕度水腫，水腫較模型組明顯減輕?？芍Ｐ徒M大鼠腦組織明顯水腫，模型成立。管花肉蓯蓉苯乙醇總苷、大花紅景天可以降低高原腦水腫模型大鼠腦水腫程度。具體結果見圖1。

圖1 PhGs-Ct對高原腦水腫大鼠腦組織病理改變的影響(HE×400)

3.2PhGs-Ct對高原腦水腫大鼠腦組織濕干比的影響

與正常對照組相比，模型組腦組織濕干比顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明模型成立。PhGs-Ct低、中、高劑量組和大花紅景天組大鼠腦組織濕干比與模型組相比均降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，管花肉蓯蓉苯乙醇總苷各劑量組與大花紅景天組腦組織濕干比比較，差異無統(tǒng)計學意義。具體結果見表1。

表1 PhGCs對高原腦水腫大鼠腦組織濕干比的影響

注：**表示與正常對照比，P<0.01；##表示與模型組比，P<0.01。

3.3PhGs-Ct對高原腦水腫大鼠腦組織AQP4表達的影響

用免疫組織化學法檢測腦組織AQP4的表達發(fā)現(xiàn)，AQP4主要在大鼠腦組織脈絡叢表達?？瞻讓φ战M大鼠腦組織AQP4表達弱陽性，在急性高原病模型組大鼠腦組織強陽性表達，PhGs-Ct低、中、高劑量組和大花紅景天組大鼠腦組織AQP4表達弱陽性，尤其是PhGs-Ct低劑量組大鼠腦組織AQP4表達接近正常組?？芍Ｐ徒M大鼠腦組織AQP4蛋白在調控水-電解質平衡的部位表達增多，管花肉蓯蓉苯乙醇總苷能降低高原腦水腫大鼠腦組織AQP4蛋白的表達，從而抑制水腫的發(fā)生。具體結果見圖2。

3.4PhGs-Ct對高原腦水腫大鼠腦組織AQP4 mRNA表達的影響

熒光定量PCR檢測腦組織AQP4 mRNA的表達發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，模型組大鼠腦組織AQP4 mRNA表達量顯著升高，是其2.21倍(P<0.01)。與模型組相比，PhGs-Ct低劑量組、PhGs-Ct中劑量組、PhGs-Ct高劑量組和大花紅景天組大鼠腦組織AQP4 mRNA表達量下降(分別為正常對照組的1.20、1.03、1.12和1.09倍)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。PhGs-Ct各劑量組與大花紅景天組相比差異無統(tǒng)計學意義。PhGs-Ct中劑量組、PhGs-Ct高劑量組和大花紅景天組可使大鼠腦組織AQP4 mRNA表達量恢復到正常水平(P>0.05)。具體結果見表2。

3.5AQP4 mRNA表達量與腦組織含水量的相關性分析

利用線性回歸分析各組大鼠腦組織濕干比與AQP4 mRNA表達量的相關性，方差分析結果F=192.112，P<0.01，R2=0.773，線性關系見圖3?？梢娔X組織含水量與AQP4 mRNA表達量成正比，腦水腫程度與AQP4 mRNA表達量正相關。

圖2 PhGs-Ct對高原腦水腫大鼠腦組織AQP4表達的影響

動物數(shù)腦組織AQP4mRNA/正常對照組正常對照組121.00±0.00模型組122.21±0.46大花紅景天組121.09±0.22##PhGs-Ct低劑量組121.20±0.30##PhGs-Ct中劑量組121.03±0.17##PhGs-Ct高劑量組121.12±0.33##

注：##表示與模型組比，P<0.01。

圖3 濕干比與AQP4 mRNA表達量線性回歸散點圖

4 討論

水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一組對水有高度選擇性的膜轉運蛋白，廣泛分布于各種組織，在水的分泌和吸收，細胞內外水平衡過程中發(fā)揮著重要作用。迄今為止，在哺乳動物體內發(fā)現(xiàn)至少有13種水通道蛋白，即AQP0～AQP12，其主要功能是便于水和一些小分子溶質如甘油、尿素等的快速跨膜運動。中樞神經系統(tǒng)存在的水通道蛋白主要為AQP1 和AQP4，其中尤以AQP4分布最為廣泛[11]，AQP4具有高度快速轉運水的能力，比其它的水通道蛋白對水的通透性強3～4倍，在腦內水電解質平衡的調節(jié)上發(fā)揮著重要作用[12-13]。研究表明AQP4與腦水腫發(fā)生密切相關[14-15]。

本研究結果表明，管花肉蓯蓉苯乙醇總苷可以降低高原腦水腫模型大鼠腦組織的濕干比，能夠預防高原腦水腫的發(fā)生發(fā)展。本研究采用免疫組化法檢測了各組大鼠腦組織AQP4的表達，并用熒光定量PCR檢測了AQP4 mRNA在大鼠腦組織中表達量的變化，發(fā)現(xiàn)高原腦水腫模型大鼠腦組織AQP4蛋白和mRNA表達量顯著增加，提示AQP4參與了高原腦水腫的形成。管花肉蓯蓉苯乙醇總苷可以抑制高原腦水腫模型大鼠腦組織AQP4蛋白和mRNA的表達，可能通過抑制AQP4的表達來預防高原腦水腫的發(fā)生。含水量的增加是組織水腫的重要標志，本研究通過計算組織濕干比表示組織含水量的多少，通過線性回歸發(fā)現(xiàn)腦組織干濕比與AQP4 mRNA表達量正相關，肉蓯蓉改善腦水腫與其抑制水通道蛋白AQP4的表達有一定聯(lián)系。隨著西部大開發(fā)的深入進行和旅游業(yè)的長足發(fā)展，越來越多的平原居民將進入高原環(huán)境，所以由高原環(huán)境引起的高原病的防治極為重要。本研究表明，肉蓯蓉具有預防高原腦水腫的潛在作用，為肉蓯蓉新用途的拓展提供實驗依據。

目前高原腦水腫動物的相關研究中，很少研究動物整體行為的改變[15-16]。但急性高原病患者首先出現(xiàn)的一系列神經學癥狀，如頭痛、惡心、嘔吐、失眠、疲乏、頭昏眼花、共濟失調等，重者精神智力障礙以至昏迷。這些神經學癥狀是以大腦病變?yōu)榛A的，即早期的血腦屏障病變到極端嚴重情況——高原腦水腫(HACE)[17]。本研究結果提示肉蓯蓉具有預防高原腦水腫的潛在作用，可能會有效預防上述癥狀的發(fā)生。

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PreventiveEffectofPhenylethanoidGlycosidesfromCistanchetubulosaonRatswithHighAltitudeCerebralEdema

TAOYicun1，DONGXiang2，XUYonghua2，JINChunli1，TUPengfei3*

(1.BasicMedicalDepartmentOfXinjiangMedicalUniversities，Urumqi830011，China；2.XinjiangGeneralHospitalofLanzhoumilitaryregion，Urumqi，830011，China；3.SchoolofPharmacy，PekingUniversity，Beijing100191，China)

Objective：To observe the effect and mechanism of phenylethanoid glycosides fromCistanchetubulosa(PhGs-Ct)on rats with high-altitude cerebral edema.Methods：PhGs-Ct was given prophylactically for 10 days.Then the rats model of high-altitude cerebral edema was established by using hypobaric chamber in a simulated environment of 5000 m altitude.Pathologic changes of rat brain tissue，the wet/dry weight ratios(W/D)of brain，the expression of AQP4 mRNA and protein were observed.Results：Compared with the control group，the high altitude cerebral edema model rats showed the remarkable character of cerebral edema and the higher W/D of brain(5.14±0.16 vs 4.65±0.10)，and the expression of AQP4 mRNA(2.21±0.46)and protein were increased.While PhGs-Ct were able to decrease W/D of brain(4.68±0.08，4.66±0.10，4.66±0.18 respectively)，reduce the expression of AQP4 mRNA(1.20±0.30，1.03±0.17，1.12±0.33 respectively)and protein in brain tissue，improve pathological change of brain tissue.Conclusion：PhGs-Ct is able to prevent the high altitude cerebral edema via decreasing the protein and mRNA expression of AQP4 in brain tissue.

Cistanche tubulosa；PhGs-Ct；high altitude cerebral edema；AQP4

2015-03-30)

國家自然科學基金項目(NO 81160416)

*

屠鵬飛，教授，研究方向：天然藥物活性成分與新藥研究、中藥質量分析；Tel：(010)82802750，E-mail： pengfeitu@bjmu.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.4.002