龐晶瑤，李雨萌，柏兆方，趙艷玲，趙奎君，馬致潔*，王伽伯*，肖小河

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050；2.解放軍302醫(yī)院 全軍中藥研究所，北京 100039；3.云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500)

·基礎(chǔ)研究·

基于高內(nèi)涵分析的何首烏對(duì)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷的配伍減毒研究△

龐晶瑤1，2，李雨萌3，柏兆方2，趙艷玲2，趙奎君1，馬致潔1*，王伽伯2*，肖小河2

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050；2.解放軍302醫(yī)院 全軍中藥研究所，北京 100039；3.云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500)

目的：觀察何首烏對(duì)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷的配伍減毒情況，為其臨床合理用藥提供參考。方法：采用高內(nèi)涵分析技術(shù)，檢測(cè)何首烏與茯苓、甘草、三七在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞上的配伍減毒情況。結(jié)果：何首烏對(duì)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的損傷呈劑量依賴性，在IC50的劑量下，分別配伍不同濃度的茯苓、甘草、三七都有顯著的減毒作用，且呈劑量依賴性。何首烏配伍茯苓減毒的效果較好，甘草次之，三七稍差。結(jié)論：采用高內(nèi)涵分析方法更加直觀、具體地反映何首烏與茯苓、甘草、三七的配伍減毒效果，為臨床用藥的安全性、合理性提供依據(jù)。

何首烏；配伍減毒；肝竇內(nèi)皮細(xì)胞；高內(nèi)涵分析

近年來，臨床上服用何首烏致肝損傷的病例日益增多，作為“四大仙草”之一的常用補(bǔ)益類中藥，何首烏的安全性受到質(zhì)疑。2013年10月、2014年7月我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)相繼出臺(tái)關(guān)于何首烏及其相關(guān)制劑的通告，提示口服何首烏及其成方制劑可能有引起肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)。我國(guó)傳統(tǒng)的中藥減毒方法有兩種，分別為炮制減毒和配伍減毒。本文擬從配伍減毒的角度出發(fā)，在細(xì)胞水平上對(duì)何首烏配伍減毒情況進(jìn)行研究。

何首烏作為保健類中藥，在中國(guó)歷史上有廣泛的應(yīng)用，但古人對(duì)其導(dǎo)致肝損傷的記載很少。據(jù)本草考證：“首烏以茯苓為使”，古人多強(qiáng)調(diào)首烏與茯苓配伍使用。2013年CFDA提示關(guān)注的5個(gè)含何首烏的制劑(養(yǎng)血生發(fā)膠囊、首烏丸、首烏片、首烏延壽片、首烏延壽顆粒)皆沒有與茯苓配伍使用。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，何首烏配伍茯苓的現(xiàn)代研究較少。合適的配伍方法是否有助于降低何首烏的肝毒性，值得我們?nèi)ド钊胙芯?。在臨床上被廣泛使用的解百藥毒、調(diào)和諸藥的甘草與何首烏配伍使用是否有助于緩和何首烏的毒性，也未見報(bào)道。另外，近期課題組在研究何首烏的肝毒性時(shí)發(fā)現(xiàn)，其能導(dǎo)致肝臟微循環(huán)灌注障礙[1]?；钛?三七)是否能改善首烏引起的微循環(huán)障礙，達(dá)到減毒的作用，也未見相關(guān)報(bào)道。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞作為肝臟代謝的屏障，大部分藥物經(jīng)肝臟代謝時(shí)會(huì)首先受累。為此，本研究以原代肝竇內(nèi)皮細(xì)胞為模型，采用高內(nèi)涵分析方法[2]，考察首烏與茯苓、甘草、三七的配伍減毒情況，尋找合適的配伍減毒方法，為臨床何首烏的合理用藥提供參考。

1 試藥和儀器

1.1 試藥

肝竇內(nèi)皮細(xì)胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基(武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：Med-0002)；胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司)；青霉素；鏈霉素；磷酸鹽緩沖液；96孔板(Costar 3599，康寧公司)；二甲基亞砜(DMSO)；除菌濾器(25 mm，0.22 μm)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶(430720，康寧公司)；Hochest 33342(H3570，生命科學(xué))；SYTOX?Orange Nucleic Acid Stain(S11368，生命科學(xué))；水為超純水。茯苓、甘草、三七由解放軍第三〇二醫(yī)院中藥房提供；何首烏(北京綠野藥業(yè)有限公司，批號(hào)：13101701)經(jīng)解放軍第三〇二醫(yī)院肖小河研究員鑒定為蓼科植物何首烏的干燥塊根。

1.2 儀器

高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)(Molecular Devices公司)；TC10TM自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Bio-Rad公司)；恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(NAPCO公司)；常規(guī)倒置顯微鏡(上海澤權(quán)儀器設(shè)備有限公司)；臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；回流提取裝置、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；ZK-82B 型真空干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠)；AL204微量分析天平(Mettler Toledo公司)；LGJ-18型冷凍干燥機(jī)(北京西四環(huán)科學(xué)儀器廠)；高壓蒸汽滅菌器(SN510C，重慶雅馬拓科技有限公司)。

2 方法

2.1 樣品制備

首烏制備方法：采用50%乙醇冷浸提取2次，每次24 h，提取溶劑為8倍，過濾，合并濾液，減壓蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥得凈膏，出膏率為15.7%[3]。

茯苓制備方法：采用加熱回流，固液比為1∶12，提取次數(shù)為2次，提取時(shí)間為100 min，水浴蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥得凈膏，出膏率為2.28%[4]。

甘草制備方法：采用加熱回流，加10倍量水，回流提取2次，提取時(shí)間分別為1.5、1 h，合并濾液并減壓濃縮，冷凍干燥得凈膏，出膏率為23.58%[5]。

三七制備方法：10倍量水，加熱回流提取2次，提取時(shí)間分別為2、1 h，合并濾液并減壓濃縮，冷凍干燥得凈膏，出膏率為37.17%。

2.2 肝竇內(nèi)皮細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法

正常人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞購自武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司。在含有10%的胎牛血清、100 U·mL-1的青霉素、100 μg·mL-1的鏈霉素的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期進(jìn)行。細(xì)胞均勻接種在96孔板中，每孔5000個(gè)細(xì)胞，鋪板24 h后給藥，給藥24 h后進(jìn)行熒光染色。本實(shí)驗(yàn)采用二重?zé)晒鈽?biāo)記法，用質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1的Hochest 33342(Ex/Em：350/461 nm)標(biāo)記所有細(xì)胞的細(xì)胞核顯藍(lán)色；用濃度為1 μmol·L-1的SYTOX?Orange Nucleic Acid Stain(Abs/Em：547/570 nm)標(biāo)記死細(xì)胞的細(xì)胞核顯橙色。于37 ℃避光孵育15 min，細(xì)胞被標(biāo)記好后，由高內(nèi)涵儀器直接對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并分析各孔的細(xì)胞存活情況。精確稱量何首烏總提物50 mg，溶于DMSO中作為儲(chǔ)液備用。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法

用ImageXpress Micro XL高內(nèi)涵軟件對(duì)圖像進(jìn)行處理分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以GraphPad Prism 5.0、IBM SPSS Statistics 20、OriginPro 8.5軟件處理，所有數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P<0.05設(shè)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1何首烏總提取物對(duì)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果及IC50值

本實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)濃度梯度，3倍稀釋，最高質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1(相當(dāng)于生藥量12.74 mg·mL-1)，用ImageXpress Micro XL高內(nèi)涵儀器，采用二重?zé)晒鈽?biāo)記法(Hochest 33342標(biāo)記所有的細(xì)胞，SYTOX?Orange Nucleic Acid Stain標(biāo)記死細(xì)胞)，以每孔活細(xì)胞的百分比作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用GraphPad Prism 5.0 軟件處理，結(jié)果：LogIC50值為-0.12，計(jì)算IC50為0.76 mg·mL-1(相當(dāng)于生藥量4.84 mg·mL-1)。見圖1。

圖1 何首烏總提取物作用于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的IC50值

3.2基于高內(nèi)涵分析評(píng)價(jià)何首烏與茯苓、甘草、三七的配伍減毒情況

3.2.1首烏與茯苓、甘草、三七的配伍減毒情況高內(nèi)涵成像結(jié)果，見圖2～3。實(shí)驗(yàn)取IC50值作為何首烏的配伍實(shí)驗(yàn)用量，分別配伍不同濃度的茯苓、甘草、三七，復(fù)6孔，分別作對(duì)照。用ImageXpressMicroXL高內(nèi)涵儀器分析，采用二重?zé)晒鈽?biāo)記法(Hochest33342標(biāo)記所有細(xì)胞顯藍(lán)色，SYTOX?OrangeNucleicAcidStain標(biāo)記死細(xì)胞顯橙色)，以每孔活細(xì)胞的百分比作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用OriginPro8.5軟件作圖。

注：A.首烏；B.首烏+茯苓；C.首烏+甘草；D.首烏+三七；茯苓質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1；甘草質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1；三七質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1。圖2 首烏與茯苓、甘草、三七的配伍減毒高內(nèi)涵成像結(jié)果

圖2顯示，單純何首烏組死細(xì)胞數(shù)很多，大約占細(xì)胞總數(shù)的45%；首烏+茯苓組的死細(xì)胞數(shù)很少，約占3%；首烏+甘草組的死細(xì)胞數(shù)較少，約占10%；首烏+三七組的死細(xì)胞數(shù)較多，約占20%。從染色結(jié)果來看，首烏配伍茯苓的減毒效果最好。

3.2.2高內(nèi)涵軟件統(tǒng)計(jì)分析各孔的活細(xì)胞數(shù)及其百分比，綜合評(píng)價(jià)何首烏與不同濃度的茯苓、甘草、三七在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞上的配伍減毒情況，見圖3～5。

注：*P<0.05；**P<0.01。下同。圖3 何首烏與不同濃度的茯苓配伍減毒結(jié)果

圖4 首烏與不同濃度的甘草配伍減毒結(jié)果

圖5 首烏與不同濃度的三七配伍減毒結(jié)果

結(jié)合圖3～5可以看出：首烏濃度為4.84mg·mL-1(生藥量)時(shí)，對(duì)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的抑制作用，配伍茯苓提取物質(zhì)量濃度為0.07～2mg·mL-1，合生藥首烏∶茯苓為1∶(1.58～0.055)；配伍甘草提取物質(zhì)量濃度為0.15～4mg·mL-1，合生藥首烏∶甘草為1∶(7.61～0.285)；三七提取物質(zhì)量濃度為0.037～1mg·mL-1，合生藥首烏∶三七為1∶(48.89～1.80)。三者都能明顯地降低何首烏對(duì)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用，且茯苓的減毒效果相對(duì)較好。

4 討論

古代本草記載“首烏以茯苓為使”，現(xiàn)在何首烏的使用較少見規(guī)范的配伍減毒應(yīng)用，而其肝毒性屢見報(bào)道，為明確首烏的肝毒性是否與合理的配伍有關(guān)，本研究在細(xì)胞水平上分別考察了茯苓、甘草、三七與何首烏配伍使用對(duì)其肝毒性的影響。結(jié)果顯示三者都能明顯地降低何首烏的肝細(xì)胞毒性，且茯苓的效果較好，在一定程度上佐證了古代首烏與茯苓相使為用的科學(xué)性。

盡管現(xiàn)在對(duì)何首烏的肝毒性報(bào)道很多，但我們要對(duì)此有客觀全面的認(rèn)識(shí)，從不同角度探索何首烏的毒性問題。前期課題組從炮制減毒的角度探討了何首烏的毒性情況，結(jié)果顯示，合理的炮制方法能在一定程度上降低其肝毒性。本文從配伍減毒的角度探討了首烏的減毒情況，表明在細(xì)胞水平上首烏與茯苓、甘草、三七配伍確實(shí)能降低其毒性作用。雖然體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)不能完全模擬人體的自身代謝，但卻能給臨床上首烏的配伍減毒提供參考。本文沒有在中醫(yī)的理論指導(dǎo)下應(yīng)用，今后需要緊密結(jié)合臨床，在動(dòng)物水平上進(jìn)行更加深入的研究，尋求最好的配伍解毒方法和最佳的配伍比例。

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CompatibilityAttenuatedDetoxificationstudyonRadixPolygoniMultiflori-causedHepaticSinusEndothelialCellInjuryBasedonHighContentAnalysis

PANGJingyao1，2，LIYumeng3，BAIZhaofang2，ZHAOYanLing2，ZHAOKuijun1，MAZhijie1*，WANGJiabo2*，XIAOXiaohe2

(1.BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China；2.ChinaMilitaryInstituteofChineseMedicine，302MilitaryHospital，Beijing100039，China；3.YunnanUniversityOfTCM，CollegeofTraditionalChineseMedicine，Kunming650500，China)

Objective：To observe the compatibility attenuated detoxification of Radix Polygoni Multiflori-caused hepatic sinus endothelial cell injury，and provide reference for the further study of the clinical rational medication.Methods：The High Content Analysis was applied to detect the compatibility attenuated detoxification of Radix Polygoni Multiflori-caused hepatic sinus endothelial cell injury with Poria cocos，Radix Glycyrrhizae and Radix notoginseng.Result：A dose dependent relation existed between Radix Polygoni Multiflori and hepatic sinus endothelial cells injury，which was embedded significantly in compatibility attenuated detoxification with different concentration of Poria cocos，Radix Glycyrrhizae and Radix notoginsen under the dose of IC50.Compatibility attenuated detoxification with Poria cocos effected better，of which with Radix notoginseng was the least potent.Conclusion：Compatibility attenuated detoxification effect of Radix Polygoni Multiflori and Poria cocos，Radix Glycyrrhizae and Radix notoginsen was specifically reflected through High Content Analysis，which may provide a scientific basis for the safety and rationality of clinical medication.

Radix Polygoni Multiflori；compatibility attenuated detoxification；hepatic sinus endothelial cells；High Content Analysis

2014-11-30)

國(guó)家重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng)課題(2015ZX09501-004-001-008)；國(guó)家公益性行業(yè)專項(xiàng)課題(201507004-04)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81373984，81403126)

*

王伽伯，博士，助理研究員，研究方向：中藥藥性與毒性評(píng)價(jià)；Tel：(010)66933325，E-mail：pharm_sci@126.com 馬致潔，博士，藥師，研究方向：中藥藥理與毒理研究；E-mail：13811647091@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.4.008