王立芳，徐振曄，司海龍，王中奇，鄧海濱，蘇婉

(上海中醫(yī)藥大學(xué) 附屬龍華醫(yī)院 腫瘤二科，上海 200032)

·基礎(chǔ)研究·

芪精多糖片治療化療骨髓抑制的藥效評(píng)價(jià)及調(diào)控Notch表達(dá)的研究△

王立芳，徐振曄*，司海龍，王中奇，鄧海濱，蘇婉

(上海中醫(yī)藥大學(xué) 附屬龍華醫(yī)院 腫瘤二科，上海 200032)

目的：進(jìn)一步評(píng)價(jià)芪精多糖片治療骨髓抑制小鼠的療效，探討其作用機(jī)制。方法：采用小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺造成化療骨髓抑制模型，用芪精多糖片干預(yù)治療，常規(guī)計(jì)數(shù)白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板、骨髓有核細(xì)胞數(shù)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Sca-1+CD34+細(xì)胞以比較骨髓造血干細(xì)胞比例，F(xiàn)Q-PCR法檢測(cè)Notch1、Notch2 mRNA表達(dá)。結(jié)果：治療組白細(xì)胞、骨髓有核細(xì)胞、造血干細(xì)胞數(shù)、Notch1表達(dá)、Notch2表達(dá)均高于模型對(duì)照組，血小板、紅細(xì)胞治療組與模型組未發(fā)現(xiàn)差異。結(jié)論：芪精多糖片具有良好的升高化療骨髓抑制小鼠白細(xì)胞的作用，其作用機(jī)理與調(diào)控Notch1、Notch2 mRNA表達(dá)、促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞增殖有關(guān)。

芪精多糖；骨髓抑制；造血干細(xì)胞

芪精多糖片來(lái)源于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院徐振曄教授的經(jīng)驗(yàn)方藥雙黃升白方，屬于中藥成分組合制劑，目前劑型為片劑，主要用于治療腫瘤化療導(dǎo)致的骨髓抑制(主要表現(xiàn)為白細(xì)胞降低)，前期研究已明確該藥具有良好的改善化療骨髓抑制期骨髓造血功能的作用，升高白細(xì)胞療效較好，且已確定最佳服用及有效劑量[1-5]。本研究在前期基礎(chǔ)上對(duì)其治療化療骨髓抑制的藥理藥效進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)近交系昆明小鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，合格證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002，雄性，20 g左右。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院SPF級(jí)飼養(yǎng)室，動(dòng)物房設(shè)施許可證號(hào)SYXK(滬)2010-0095。

1.2 主要藥物與試劑

芪精多糖片(上海靜安制藥廠，批號(hào)：141104-1)；注射用環(huán)磷酰胺(CTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：13052425)；cDNA合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(bioline公司)；CD34抗體、Sca-1抗體(biolegend公司)；引物探針(上海捷瑞生物工程公司)，Notch1引物序列：Sense：5′actgtgacagccagtgcaac 3′，Antisense：5′gccatcactgaagtggtcct 3′；Notch2引物序列Sense：5′ cagcactgtgacagccctta 3′，Antisense：5′aggtgctcccttcaaaacct 3′。內(nèi)參GAPDH引物序列Sense：5′aactttggcattgtggaagg3′，Antisense：5′ggatgcagggatgatg-ttct3′。

2 方法

2.1 模型制備及分組

24只昆明小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、治療組，每組8只。正常組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2 mL，連續(xù)3 d；灌服0.9%氯化鈉溶液0.4 mL·d-1，連續(xù)6 d。模型組腹腔注射CTX用法同治療組；灌服0.9%氯化鈉溶液0.4 mL·d-1，連續(xù)6 d。治療組腹腔注射CTX 2 mL·d-1，相當(dāng)于100 mg·kg-1·d-1，連續(xù)3 d；灌服芪精多糖溶液(藥物劑量采用前期研究確定最佳服藥劑量[5])0.4 mL·d-1，相當(dāng)于芪精多糖0.66 g·kg-1·d-1(黃芪多糖0.45 g，黃精多糖0.21 g)，連續(xù)6 d。

2.2 觀察指標(biāo)及方法

各組分別于最后一天用藥后2 h摘眼球采血，頸椎脫臼處死，無(wú)菌無(wú)RNA酶條件下迅速剝?nèi)‰p側(cè)股骨，以醫(yī)用剪刀剪開(kāi)小鼠股骨兩端，露出骨髓腔，備用。觀測(cè)以下指標(biāo)：(1)血常規(guī)：KT6180全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀觀察外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板的數(shù)量；(2)骨髓有核細(xì)胞數(shù)：取左側(cè)股骨，以1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)液反復(fù)沖洗，直至骨髓腔發(fā)白，將洗脫的骨髓細(xì)胞置于1.5 mL離心管，取0.1 mL用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，顯微鏡下計(jì)數(shù)有細(xì)胞核的細(xì)胞數(shù)量(不包括無(wú)細(xì)胞核的成熟紅細(xì)胞)，計(jì)數(shù)所得的10倍即為單側(cè)股骨總有核細(xì)胞數(shù)。(3)骨髓造血干細(xì)胞數(shù)：左側(cè)骨髓迅速進(jìn)行有核細(xì)胞計(jì)數(shù)后，加入紅細(xì)胞裂解液，去除紅細(xì)胞，PBS洗后重新懸浮，以Sca-1+CD34+為標(biāo)記檢測(cè)小鼠骨髓造血干細(xì)胞，吸取100 μL細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度≥1×106個(gè)· mL-1)，分別加入10 μL PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠Sca-1抗體和FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD34抗體，同時(shí)以不加抗體的細(xì)胞懸液作陰性對(duì)照，室溫避光孵育20 min，重新懸浮，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。(4)Notch1、Notch2 mRNA表達(dá)：無(wú)菌無(wú)RNA條件下迅速取右側(cè)股骨，PBS反復(fù)沖洗出骨髓，收集骨髓細(xì)胞，常規(guī)進(jìn)行總mRNA的抽提，F(xiàn)Q-PCR法檢測(cè)Notch1與Notch2 mRNA表達(dá)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，內(nèi)參及Notch1、Notch2溶解曲線見(jiàn)圖1-3。

圖1 GAPDH熔解曲線

圖2 Notch 1溶解曲線

圖3 Notch 2溶解曲線

詳細(xì)方法如下：將骨髓細(xì)胞置于研磨器(1.5 mL EP管)中，加入1 mL預(yù)冷的Trizol研磨，常規(guī)進(jìn)行mRNA抽提；cDNA第一鏈合成(反應(yīng)條件：45 ℃ 30 min逆轉(zhuǎn)錄；85 ℃，5 min，滅活MMLV)，-20 ℃冰箱，保存，待用；real-timePCR檢測(cè)，PCR擴(kuò)增檢測(cè)條件見(jiàn)表1。

表1 PCR擴(kuò)增檢測(cè)條件

數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件ABI Prism 7500 SDS Software分析。mRNA相對(duì)表達(dá)量=2-Δct×100%，Δct=目標(biāo)基因CT值-內(nèi)參(GAPDH)CT值。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 血常規(guī)分析

模型組應(yīng)用CTX造模后白細(xì)胞較正常組明顯下降，而治療組雖然較正常組白細(xì)胞降低，但高于模型組(P<0.05)，因此可以推論芪精多糖片具有升高骨髓抑制小鼠白細(xì)胞的作用。模型組血小板較正常組降低(P<0.05)，但與治療組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，有待今后增大樣本量進(jìn)一步觀察。模型組紅細(xì)胞較正常組與治療組低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，考慮與紅細(xì)胞壽命較長(zhǎng)、本研究觀察期較短有關(guān)，有待今后延長(zhǎng)觀察期以進(jìn)一步明確芪精多糖片是否對(duì)骨髓紅系造血功能有促進(jìn)作用。見(jiàn)表2。

表2 各組白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)比較

注：與模型組比較，*P<0.05；與正常組比較，△P<0.05；下同。

3.2 骨髓有核細(xì)胞數(shù)

骨髓有核細(xì)胞數(shù)是反應(yīng)骨髓造血功能的主要指標(biāo)之一。模型組骨髓有核細(xì)胞數(shù)明顯低于正常組(P<0.05)，而治療組骨髓有核細(xì)胞數(shù)未見(jiàn)明顯降低(P>0.05)，考慮應(yīng)用CTX后骨髓造血功能抑制，骨髓有核細(xì)胞數(shù)減少，應(yīng)用芪精多糖片干預(yù)后造血功能抑制減輕、恢復(fù)加快。見(jiàn)表3。

表3 小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)的比較

3.3 造血干細(xì)胞數(shù)量比較

CD34、Sca-1為小鼠骨髓造血干細(xì)胞標(biāo)志物，模型組及治療組Sca-1+CD34+細(xì)胞比例高于正常組(P<0.05)，考慮與第4天停用CTX后骨髓造血功能進(jìn)入恢復(fù)期、造血干細(xì)胞增殖加速有關(guān)。治療組Sca-1+CD34+細(xì)胞比例高于模型組(P<0.05)，結(jié)合骨髓有核細(xì)胞數(shù)量比較，考慮芪精多糖片具有較好的促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞增殖的作用，見(jiàn)圖4-6、表4。

3.4 Notch1與Notch2 mRNA表達(dá)

Notch信號(hào)能促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖，其mRNA表達(dá)高低可從一定程度上反映骨髓造血細(xì)胞增殖情況。本研究中Notch1 mRNA表達(dá)治療組較模型組及正常組均升高(P<0.05)，模型組則較治療組降低(P<0.05)，Notch2表達(dá)模型組與正常組無(wú)差異(P>0.05)，治療組較模型組及正常組均明顯升高(P<0.05)?？紤]芪精多糖片具有促進(jìn)化療骨髓抑制小鼠骨髓中Notch1、Notch2 mRNA表達(dá)的作用。見(jiàn)表5。

圖4 正常組造血干細(xì)胞比例圖

圖5 模型組造血干細(xì)胞比例圖

圖6 治療組造血干細(xì)胞比例圖

表4 小鼠造血干細(xì)胞(Sca-1+CD34+細(xì)胞)的比較

表5 小鼠骨髓Notch1、Notch2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

4 討論

骨髓抑制是腫瘤化療常見(jiàn)不良反應(yīng)，主要表現(xiàn)為外周血細(xì)胞(尤其是白細(xì)胞)降低，目前治療腫瘤化療骨髓抑制主要采用集落刺激因子(CSF)促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞增殖分化。然而，造血干細(xì)胞的增殖分化更多地依賴于造血微環(huán)境的調(diào)控，CSF僅是其中的一方面因素。芪精多糖是來(lái)源于上海市名中醫(yī)徐振曄教授經(jīng)驗(yàn)方藥的中藥組分制劑，具有良好的臨床基礎(chǔ)[2]，前期研究已發(fā)現(xiàn)該藥物成分組合對(duì)于骨髓造血微環(huán)境具有良好的保護(hù)和促進(jìn)作用。

Notch是造血系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中的一條重要信號(hào)通路，與造血干細(xì)胞增殖、分化、自我更新密切相關(guān)，存在于所有已知?jiǎng)游锛?xì)胞中，介導(dǎo)細(xì)胞間的局部信號(hào)傳遞及相應(yīng)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，能夠擴(kuò)大并固化相鄰細(xì)胞之間的分子差異，最終決定細(xì)胞的命運(yùn)[6]。抑制Notch信號(hào)能加速造血干細(xì)胞的分化，降低其造血重建能力[7]。本研究發(fā)現(xiàn)治療組Notch1、Notch2 mRNA表達(dá)升高，說(shuō)明芪精多糖能加速這種功能恢復(fù)過(guò)程，因此我們認(rèn)為芪精多糖治療骨髓抑制的機(jī)制與調(diào)控Notch表達(dá)有關(guān)。

組分中藥是21世紀(jì)中藥新藥研究和開(kāi)發(fā)的創(chuàng)新模式，它突破了傳統(tǒng)中藥方劑成分較為繁雜、藥效和藥物質(zhì)量不穩(wěn)定等缺陷。在傳統(tǒng)祖國(guó)醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下，將所提取中藥有效組分進(jìn)行配伍和組方，所制成的復(fù)方制劑，既具有現(xiàn)代藥理學(xué)的現(xiàn)代性，且又兼?zhèn)渲兴帍?fù)方配伍聯(lián)合應(yīng)用的傳統(tǒng)特點(diǎn)，可闡明多個(gè)有效組分之間的相互作用的性質(zhì)(增效、拮抗、相加)[8]。與傳統(tǒng)中藥方劑相比，組分中藥具有“安全、有效、穩(wěn)定、可控”的藥物特征，還具有復(fù)方、配伍、多途徑、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)整合調(diào)控作用模式等中醫(yī)藥特點(diǎn)[9]。芪精多糖目前已制成片劑，制劑工藝簡(jiǎn)捷，藥品質(zhì)量穩(wěn)定，口感良好，本研究對(duì)其治療化療骨髓抑制的療效進(jìn)行了進(jìn)一步評(píng)價(jià)，從調(diào)控Notch信號(hào)角度對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了探討，為其向臨床新藥轉(zhuǎn)化提供了理論基礎(chǔ)，但該藥對(duì)紅細(xì)胞及血小板的影響尚待進(jìn)一步研究，今后進(jìn)一步闡述其作用機(jī)制有利于促進(jìn)該制劑申報(bào)新藥，為臨床治療腫瘤化療骨髓抑制提供新的選擇。

[1] 吳秋霞.黃芪黃精藥對(duì)主要組分配伍配比對(duì)骨髓抑制小鼠造血系統(tǒng)保護(hù)作用的研究[D].上海：上海中醫(yī)藥大學(xué)，2011.

[2] Xu Zhenye，Zhu Yanwei，Zhou Weidong，et al.Clinical Observation on Effect of Shuanghuang SengbaiGranule on Chemotherapy Induced Myelosuppression in Tumor Patients and on Ultrastructure of Bone Marrow in Mice[J].CJIM，2001，7(4)：277-281.

[3] Xian Gu，Zhenye Xu，LingYu Zhu，et al.Dual control of Shuanghuang Shengbai Granule on CyclinD-CDK4/6 signal pathway of cell reproductive cycles in Lewis-bearing mice with cyclophosphamide-induced myelosuppression[J].Onco Targets and Therapy，2013，6：199-209.

[4] 顧賢，徐振曄，王立芳，等.雙黃升白顆粒雙向調(diào)控細(xì)胞周期CyclinD-CDK4/6信號(hào)途徑的進(jìn)一步研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13(12)：32-35.

[5] 高嵩.芪精多糖片治療化療骨髓抑制白細(xì)胞減少癥的藥學(xué)、藥效藥理研究[D].上海：上海中醫(yī)藥大學(xué)，2015：35-38.

[6] Moellering R E，Cornejo M，Davis T N，et al.Direct inhibition of the NOTCH transcription factor complex[J].Nature，2009，462(7270)：182-188.

[7] Weber J M，Calvi L M.Notch signaling and the bone marrow hematopoietic stem cell niche[J].Bone，2010，46(2)：281-5.

[8] 葉祖光.中藥復(fù)方與組分中藥[J].中國(guó)新藥雜志，2011，20(16)：1487-1489.

[9] 苗明三，馬霄，王燦.中藥有效組分配伍研究的探討[J].中藥新藥與臨床藥理，2009，20(5)：487-490.

EfficacyEvaluationofQiJingPolysaccharideTabletsinTreatmentofBoneMarrowInhibitionCausedbyChemotherapyandResearchinRegulationofNotchExpression

WANGLifang，XUZhenye*，SIHailong，WANGZhongqi，DENGHaibin，SUWan

(TraditionalChineseMedicineTumorResearchInstituteofShanghaiUniverstityofTCM，Shanghai200032，China)

Objective：To further evaluate the treatment efficacy of Qi Jing polysaccharide tablets on mice with bone marrow suppression and explore the mechanism.Methods：The mice bone marrow suppression model caused by intraperitoneal injection of cyclophosphamide were used in the study，Qi Jing polysaccharide tablets were given for the intervention treatment.The conventional counting white blood cells，red blood cells，platelet count，bone marrow nucleated cells were measured，the Sca-1+CD34+ positive cells of bone marrow were detected by using flow cytometry to compare the stem cells number.The Notch1 and Notch2 mRNA expression were detected by FQ-PCR method.Results：The Notch1，Notch2 mRNA expression in white blood cells，bone marrow cells and hematopoietic stem cell number in the bone marrow in the treatment group were higher than those in the control group.There was no difference between treatment group and the untreated group in platelets and red blood cells counting.Conclusion：Qi Jing polysaccharide tablets have good effect on increasing white blood cells of mice with chemotherapy caused myelosuppression，the mechanism is related to regulation of Notch1，Notch2 mRNA expression and promotion of bone marrow stem cell proliferation.

Qi Jing polysaccharide tablets；myelosuppression；hematopoietic stem cell

2015-06-03)

國(guó)家自然科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目(81202670)；上海市科委自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(12ZR1431800)；上海市衛(wèi)生局資助項(xiàng)目(2011XY006)

*

徐振曄，主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥治療惡性腫瘤及相關(guān)疾??；E-mail：xuzhenye1947@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.010