苗學(xué)紅，王淑玲

補(bǔ)腎疏肝方對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的凋亡作用及其機(jī)制研究

苗學(xué)紅，王淑玲

目的探討補(bǔ)腎疏肝方對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的凋亡作用，對(duì)腫瘤壞死因子(TNF)－α分泌、Survivin及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)－3 mRNA表達(dá)的影響。方法將補(bǔ)腎疏肝方制成低劑量(1.25 g/ml)、中劑量(2.50 g/m l)和高劑量(3.75 g/ml)藥液。以隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、順鉑(DDP)組、聯(lián)合組(中劑量藥液聯(lián)合DDP)，每組10只。對(duì)照組于第1～5天給予0.9%氯化鈉溶液4 ml/d灌胃;低劑量組、中劑量組、高劑量組于第1～5天給予相應(yīng)劑量藥液4ml/d灌胃;DDP組分別于第1、3、5天腹腔注射2 m l DDP(20%);聯(lián)合組于第1～5天給予中劑量灌胃藥液灌胃4 ml/d及第1、3、5天腹腔注射2 ml DDP(20%)。末次給藥2 h后采血，分離血清。A549細(xì)胞分別加入各組血清，培養(yǎng)72 h，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。A549細(xì)胞分別加入各組血清，培養(yǎng)24、48、72 h后，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)TNF－α水平。A549細(xì)胞與各組血清共培養(yǎng)72 h后，采用熒光定量PCR檢測(cè)Survivin mRNA、Caspase－3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果各組血清作用于A549細(xì)胞72 h后，凋亡細(xì)胞核固縮，且隨藥液濃度增加凋亡細(xì)胞增多。各組血清作用于A549細(xì)胞24、48、72 h后TNF－α分泌水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中，低劑量組、中劑量組、高劑量組、DDP組和聯(lián)合組作用于A549細(xì)胞24、48、72 h后TNF－α分泌水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各組血清作用于A549細(xì)胞72 h后Survivin mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.238，P＜0.05)。其中，高劑量組、DDP組和聯(lián)合組血清作用于A549細(xì)胞72 h后Survivin mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各組血清作用于A549細(xì)胞72 h后Caspase－3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.814，P＜0.05)。其中，中劑量組、高劑量組、DDP組和聯(lián)合組血清作用于A549細(xì)胞72 h后Caspase－3 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論補(bǔ)腎疏肝方可促進(jìn)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制Survivin基因表達(dá)、促進(jìn)TNF－α分泌和Caspase－3基因表達(dá)有關(guān)。

腺癌，細(xì)支氣管肺泡;補(bǔ)腎疏肝方;A549細(xì)胞;細(xì)胞凋亡;Survivin;腫瘤壞死因子α;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

苗學(xué)紅，王淑玲．補(bǔ)腎疏肝方對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的凋亡作用及其機(jī)制研究［J］．中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18 (32):3964－3968．［www.chinagp.net］

Miao XH，Wang SL．Effects of bushenshugan formula on the apoptosis of human lung adenocarcinoma A549 cells and its mechanism［J］．Chinese General Practice，2015，18(32):3964－3968．

近年來，肺癌發(fā)病率和病死率逐年上升，已成為危害人類健康最常見的惡性腫瘤之一［1］。非小細(xì)胞肺癌約占肺癌的80%，肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌的主要病理類型。早期肺癌可采用手術(shù)治療，但多數(shù)患者確診時(shí)已到中晚期，失去了手術(shù)時(shí)機(jī)，其5年生存率低于15%［2］。同時(shí)，雖然放化療已成為中晚期肺癌的主要治療手段，但其毒副作用較多，常導(dǎo)致治療中斷。目前，中醫(yī)藥抗腫瘤已成為研究熱點(diǎn)［3］。補(bǔ)腎疏肝方由北五味子、柴胡、當(dāng)歸、枸杞子、菟絲子、女貞子、車前子、瓜蔞等十八味中藥組成，其通過行氣化瘀，疏肝解郁，養(yǎng)血活血，化痰軟堅(jiān)散結(jié)，補(bǔ)肝腎之功效，提高患者機(jī)體免疫力，提高生活質(zhì)量［4］。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)補(bǔ)腎疏肝方具有抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖的作用［5］，本研究進(jìn)一步探討補(bǔ)腎疏肝方對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物雄性SD大鼠60只，SPF級(jí)，體質(zhì)量280～320 g，由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào):SCXK(豫)2010－0002。

1.2藥品、試劑與儀器補(bǔ)腎疏肝方由北五味子、柴胡、當(dāng)歸、枸杞子、菟絲子、女貞子、車前子、瓜蔞等十八味中藥組成，單方共計(jì)210 g，分別制成低劑量(1.25 g/ml)、中劑量(2.50 g/ml)和高劑量(3.75 g/ml)藥液，4℃保存?zhèn)溆?。凍干型粉劑注射用順鉑(DDP，肺腺癌的常規(guī)化療藥物)，購(gòu)于山東齊魯制藥有限公司，批號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)H37021357，臨時(shí)配置成20%溶液。胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)液、胰酶－EDTA和Hoechst33258染色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳賽爾生物技術(shù)有限公司，4%多聚甲醛、Trigol、三氯甲烷、異丙醇、乙醇、DEPC、引物均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自康為試劑有限公司。超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)HERAEUS公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio－RAD公司，倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞由鄭州大學(xué)腫瘤實(shí)驗(yàn)中心提供。培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100μg/ L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)，隔天換液，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶壁80%時(shí)，用胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4含藥血清的制備以隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、聯(lián)合組(中劑量藥液聯(lián)合DDP)、DDP組，每組10只。對(duì)照組于第1～5天給予0.9%氯化鈉溶液4 ml/d灌胃;低劑量組、中劑量組、高劑量組于第1～5天給予相應(yīng)劑量藥液4 ml/d灌胃;DDP組分別于第1、3、5天腹腔注射2 ml DDP;聯(lián)合組于第1～5天給予中劑量藥液灌胃4 ml/d及第1、3、5天腹腔注射2 ml DDP。末次給藥2 h后采用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，無菌條件下腹主動(dòng)脈采血，靜置2 h，3 000 r/min離心20min，分離血清，56℃滅活30 min，經(jīng)0.22μm過濾除菌，將各組含藥血清與含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液以1∶9比例配制，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5Hoechst33258熒光染色取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，加入培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，每孔2 m l接種于6孔板，放入培養(yǎng)箱中過夜，使細(xì)胞鋪滿底部的50%～80%，棄去舊培養(yǎng)液，分別加入各組血清，培養(yǎng)72 h，用PBS沖洗2～3次，加入4%多聚甲醛固定液1 ml，室溫固定15 min。吸去固定液，PBS沖洗2～3次，加入0.5ml的Hoechst33258染色液，放入搖床上搖動(dòng)10 min，去掉染色液，PBS沖洗2次，放入倒置熒光顯微鏡下觀察。凋亡細(xì)胞由于染色質(zhì)固縮，細(xì)胞核呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染，熒光倒置顯微鏡下呈藍(lán)色。

1.6ELISA檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF)－α取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，以每孔1 ml接種到24孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)24 h之后，加入各組血清，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，3 000 r/min離心10 min，取上清液。從室溫

平衡20 min后的鋁箔袋中取出所需板條，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣品孔和空白孔，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入50μl標(biāo)準(zhǔn)品，在樣品孔中加入各組上清液10μl，再加稀釋液40μl，隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體50μl，封板膜封住反應(yīng)孔，放入37℃水浴鍋內(nèi)60 min，棄去液體，用洗滌液洗板5次。各孔加入底物A、B各50μl，37℃避光15 min，加入終止液50μl，15 min內(nèi)于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值。描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組TNF－α水平。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.7熒光定量PCR檢測(cè)Survivin及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)－3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量取上述培養(yǎng)72 h后細(xì)胞，胰酶進(jìn)行消化，3 000 r/min離心10min，棄上清液。根據(jù)RNA提取試劑盒，提取細(xì)胞總RNA，提取的RNA根據(jù)cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA。Survivin引物序列:上游:5'－ACCTCTTTGGGCTGGTATTG－3'，下游:5'－AACGGACAGCTTTGGATTTC－3';Caspase－3引物序列:上游:5'－GCAGAACTTACATCACCTCA－3'，下游:5'－GCATTGCTGCCTCTAGTTAT－3';β－actin內(nèi)參基因引物序列:上游:5'－ATTACGCACCATGAAGATCA－3'，下游:5'－TCGTCATACTCCTGCTTGCT－3'。取PCR反應(yīng)液43μl、Taq酶2μl，加入無菌離心管中混勻，使用微量加樣器于反應(yīng)管中加入45μl反應(yīng)液，加入RT反應(yīng)產(chǎn)物5μl。PCR條件:預(yù)變性95℃5 min，變性95℃30 s，退火62℃20 s，延伸72℃20 s，共35次循環(huán)，終延伸72℃10 min。熒光定量檢測(cè)儀檢測(cè)Survivin mRNA、Caspase－3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett－t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 Hoechst33258熒光染色各組血清作用于A549細(xì)胞72 h后，經(jīng)Hoechst 33258熒光染色，凋亡細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)邊集，呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，且隨藥液濃度增加，凋亡細(xì)胞增多，以聯(lián)合組出現(xiàn)致密濃染的細(xì)胞核最多(見圖1)。

圖1　各組血清作用于A549細(xì)胞72 h后熒光染色(Hoechst33258染色)Figure 1 Fluorescent staining of each group after 72 hours'influence of serum on A549 cells

2.2各組血清作用于A549細(xì)胞不同時(shí)間后TNF－α分泌水平比較各組血清作用于A549細(xì)胞24、48、72 h后TNF－α分泌水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中，低劑量組、中劑量組、高劑量組、DDP組和聯(lián)合組作用于A549細(xì)胞24、48、72 h后TNF－α分泌水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表1)。

表1　各組血清作用于A549細(xì)胞不同時(shí)間后TNF－α分泌水平的比較(n=3，±s，μmol/L)Table 1 Comparison of TNF－αlevel among the 6 groups at different timepoints of serum's influence on A549 cells

表1　各組血清作用于A549細(xì)胞不同時(shí)間后TNF－α分泌水平的比較(n=3，±s，μmol/L)Table 1 Comparison of TNF－αlevel among the 6 groups at different timepoints of serum's influence on A549 cells

注:DDP=順鉑;與對(duì)照組比較，aP＜0.05

組別24 h 48 h 72 h對(duì)照組3.230±0.024 4.452±0.035 4.336±0.029低劑量組6.821±0.043a7.435±0.064a9.534±0.047a中劑量組8.263±0.037a9.553±0.016a11.235±0.068a高劑量組9.864±0.068a10.648±0.028a15.437±0.032aDDP組10.215±0.029a13.594±0.026a16.721±0.012a聯(lián)合組12.357±0.082a15.820±0.038a18.113±0.015aF值12.652 9.844 13.697 P值＜0.05＜0.05＜0.05

2.3各組血清作用于A549細(xì)胞72 h后Survivin mRNA及Caspase－3 mRNA相對(duì)表達(dá)量各組血清作用于A549細(xì)胞72 h后Survivin mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F =13.238，P＜0.05)。其中，高劑量組、DDP組和聯(lián)合組血清作用于A549細(xì)胞72 h后Survivin mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見圖2)。各組血清作用于A549細(xì)胞72 h后Caspase－3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.814，P＜0.05)。其中，中劑量組、高劑量組、DDP組和聯(lián)合組血清作用于A549細(xì)胞72 h后Caspase－3 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見圖3)。

圖2　各組血清作用于A549細(xì)胞72 h后Survivin mRNA相對(duì)表達(dá)量Figure 2 Relative expression of Survivin mRNA of each group after 72 hours'influence of serum on A549 cells

圖3　各組血清作用于A549細(xì)胞72 h后Caspase－3 mRNA相對(duì)表達(dá)量Figure 3 Relative expression of Caspase－3 mRNA of each group after 72 hours'influence of serum on A549 cells

3　討論

腫瘤細(xì)胞的首要特征為細(xì)胞增殖與凋亡失衡，因此抗增殖、促凋亡是治療腫瘤的有效方法。中醫(yī)藥抗腫瘤已經(jīng)由單純臨床報(bào)道進(jìn)入較為系統(tǒng)的臨床與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的前瞻性研究。

TNF主要由活化的巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，是首個(gè)用于腫瘤生物療法的細(xì)胞因子，TNF抗腫瘤的機(jī)制有［6］:(1)體內(nèi)、體外均可殺死某些腫瘤細(xì)胞，或抑制其增殖作用;(2)提高中性粒細(xì)胞的吞噬功能;(3)引起發(fā)熱，誘導(dǎo)肝細(xì)胞急性期蛋白的合成;(4)促進(jìn)白血病細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化。夏暉等［7］研究表明，TNF－α可能通過與腫瘤細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，影響P53蛋白的表達(dá)，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡過程，發(fā)揮抗腫瘤作用。夏啟松等［8］研究表明，TNF－α在大黃素抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖和促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)腎疏肝方可促進(jìn)TNF－α的分泌，表明其對(duì)抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖和促進(jìn)凋亡具有一定作用。

Survivin具有腫瘤特異性，只表達(dá)于腫瘤和胚胎組織，與腫瘤細(xì)胞的分化增殖和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)，為凋亡抑制蛋白家族的一員，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子［9］。研究顯示，Survivin參與乳腺癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞增殖及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［10］。也有研究認(rèn)為，Survivin在甲狀腺癌組織中表達(dá)上調(diào)［11］。Singhal等［12］研究發(fā)現(xiàn)，Survivin在肺癌組織中高表達(dá)，是非小細(xì)胞肺癌最顯著的預(yù)后因子之一，其高表達(dá)抑制Caspase、Bax活性及抗腫瘤藥物效果。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)腎疏肝方作用肺腺癌A549細(xì)胞72 h后，高劑量組Survivin mRNA相對(duì)表達(dá)量下降，提示補(bǔ)腎疏肝方促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡可能與下調(diào)Survivin基因的表達(dá)有關(guān)。

Caspase是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的蛋白酶家族，Caspase－3酶原能夠被Caspase－8、Caspase－9、Caspase－10以及顆粒酶B激活，是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者。Caspase－3在多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用［13］。夏暉等［7］研究表明，TNF－α可通過促進(jìn)人肺癌A549細(xì)胞Caspase－3的蛋白表達(dá)以增強(qiáng)γ射線導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，從而提高放療敏感性，可見Caspase－3在TNF－α殺傷腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮促進(jìn)作用。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)腎疏肝方作用于肺腺癌A549細(xì)胞72 h后，中劑量組、高劑量組Caspase－3 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高，提示補(bǔ)腎疏肝方促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡可能與上調(diào)Caspase－3基因的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，補(bǔ)腎疏肝方可促進(jìn)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制Survivin基因表達(dá)、促進(jìn)TNF－α分泌和Caspase－3基因表達(dá)有關(guān)。本研究經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)補(bǔ)腎疏肝方對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的抑制作用，為其在臨床推廣提供依據(jù)。

［1］趙建平，王媛媛.人參多糖體外誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究［J］．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，26(6): 95－97．

［2］Hu JC，Li QQ.Effect of Tetramethypyrazine on the proliferation and apoptosis of lung cancer cell line of A549 and its mechanism［J］．Medical Journal ofWuhan University，2010，31(1):19－22．(in Chinese)胡家才，李清泉.川芎嗪對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其機(jī)制［J］．武漢大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，31(1):19－22．

［3］Guan XL，Luo G，Zhu L，et al．Inhibition of nobiletin on human non－small cell lung cancer cell line A549［J］．Journal of China Pharmaceutical University，2006，37(5):443－446．(in Chinese)管曉琳，羅剛，朱玲，等．川陳皮素誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的研究［J］．中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37(5):443－446．

［4］劉源，王淑玲.補(bǔ)腎散結(jié)方聯(lián)合GP方案治療晚期非小細(xì)胞肺癌臨床療效觀察［J］．中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(4):864－867．

［5］苗學(xué)紅，王淑玲，古兆森，等．補(bǔ)腎疏肝方對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的抑制及凋亡相關(guān)因子研究［J］．中華中醫(yī)藥雜志，2014，29 (8):2661－2664．

［6］Gu CP，Zhang YP.Progress on anti－tumor mechanism of tumour necrosis factor－alpha［J］．China Cancer，2007，16(2):102－105．(in Chinese)古翠萍，張沂平.TNF－α抗腫瘤作用機(jī)制新進(jìn)展［J］．中國(guó)腫瘤，2007，16(2):102－105．

［7］Xia H，Li J，Yu CH，et al．Effect of TNF－αon the apoptosis human of A549 cells［J］．Chinese Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics，2005，10(12):1381－1383．(in Chinese)夏暉，李捷，于長(zhǎng)海，等．TNF－α對(duì)人肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響［J］．中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2005，10(12):1381－1383．

［8］Xia QS，Liu JW，Sun RY，et al．Effects of emodin on cell proliferation，apoptosis and VEGF/TNF－αsecretion of human lung adenocarcinoma A549 cells［J］．Cancer Research on Prevention and Treatment，2010，37(4):387－391．(in Chinese)夏啟松，劉靜維，孫仁宇，等．大黃素對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞體外增殖凋亡及VEGF和TNF－α分泌的影響［J］．腫瘤防治研究，2010，37(4):387－391．

［9］Chen J，Qiu R，Bi YL，etal．Mechanism of apoptosis in A549 cells induced by CoCl2［J］．Journal of Medical Reaserch，2012，41 (3):58－61．(in Chinese)陳健，仇容，畢艷麗，等．二氯化鈷誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡及機(jī)制的研究［J］．醫(yī)學(xué)研究雜志，2012，41(3):58－61．

［10］Sang ZF，Wang X，Qi YX，et al．Survivin expression and its correlation with cell prolifeation in breast cancer［J］．Journal of Modern Oncology，2009，17(8):1478．(in Chinese)桑占發(fā)，王興，齊玉新，等．乳腺癌組織Survivin表達(dá)與細(xì)胞增殖的關(guān)系［J］．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2009，17(8):1478．

［11］Ma J，Li XJ，Sui J，et al．Correlations between expression of survivin and microvessd demity in thyroid carcinoma［J］．Cancer Prevention Research，2010，37(10):1149．(in Chinese)馬靜，李曉江，隋軍，等．Survivin在甲狀腺癌中的表達(dá)及與微血管生成的關(guān)系［J］．腫瘤防治研究，2010，37(10) :1149．

［12］Singhal S，Vachani A，Antin－Ozerkis D，et al．Prognostic implications of cellcycle，apoptosis，and angiogenesis biomarkers in non－small cell lung cancer:a review［J］．Clin Cancer Res，2005，11(11):3974－3986．

［13］Sanli T，Liu C，Rashid A，et al．Lovastatin sensitizes lung cancer cells to ionizing radiation:modulation of molecular pathways of radioresistance and tumor suppression［J］．J Thorac Oncol，2011，6(3):439－450．

(本文編輯:吳立波)

Effects of Bushenshugan Formula on the Apoptosis of Hum an Lung Adenocarcinom a A549 Cells and Its M echanism

MIAO Xue－h(huán)ong，WANG Shu－ling．Department of Integrative Chinese and Western Medicine，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China

Objective To explore the effects of Bushenshugan Formula(BSSGF)on the apoptosis of human lung adenocarcinoma A549 cells，the level of TNF－αand themRNA expression of Survivin and Caspase－3．M ethods BSSGFwas used tomake low－dose(1.25 g/ml)，medium－dose(2.50 g/ml)and high－dose(3.75 g/ml)liquid．Using random number tablemethod，we divided the rats into control group，low－dose group，medium－dose group，high－dose group，DDP group and combined group(medium－dose liquid combined with DDP)with 10 rats in each group．Control group was given 0.9%sodium chloride solution from day 1 to day 5;low－dose，medium－dose and high－dose groupswere given corresponding dose of liquid by 4 ml/d;DDP group was given 2 ml DDP(20%)on day 1，day 3 and day 5 by intraperitoneal infection; combined group was givenmedium－dose liquid by 4 ml/d from day 1 to day 5 and was also given 2ml DDP(20%)on day 1，day 3 and day 5 by intraperitoneal infection．Two hours after the last administration，blood samples were taken and serum was separated．A549 cells were added into the serum of each group and were cultured for 72 hours，then observed cell apoptosis by inverted fluorescencemicroscope．ELISA method was used to determine TNF－αlevel at24 h，48 h and 72 h after cultivatation．After 72 hours，fluorogenic quantitative PCR was employed to determine the relative expression of SurvivinmRNA and Caspase－3 mRNA．Results After 72 hours'influence of serum on A549 cells，cell apoptosis and karyopyknosis occurred，and the apoptotic cells increased with liquid concentration increasing．At24 h，48 h and 72 h，the 6 groupswere significantly different in the expression of TNF－α(P＜0.05)．At 24 h，48 h and 72 h，low－dose group，medium－dose group，high－dose group，DDP group and combined group were higher than control group in the expression of TNF－α(P＜0.05)．The 6 groups were significantly different in the relative expression of Survivin mRNA at 72 h(F=13.238，P＜0.05)．High－dose group，DDP group and combined group were lower(P＜0.05)than control group in the relative expression of Survivin mRNA at 72 h．The 6 groups were significantly different in the relative expression of Caspase－3 mRNA at 72 h(F=10.814，P＜0.05)．Medium－dose group，high－dose group，DDP group and combined group were higher than control group in the relative expression of Caspase－3 mRNA at72 h(P＜0.05)．Conclusion BSSGF could accelerate the apoptosis of A549 cells，and it may induce apoptosis of A549 cells by inhibiting the gene expression of Survivin，promoting the secretion of TNF－αand increasing the expression of Caspase－3．

Adenocarcinoma，bronchiolo－alveolar;Bushenshugan formula;A549 cells;Apoptosis;Survivin; Tumor necrosis factor－alpha;Caspase 3

R 730.261

A

10.3969/j.issn.1007－9572.2015.32.016

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81473497);河南省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(112300410049)

450052河南省鄭州市，鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科(苗學(xué)紅);鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(王淑玲)

王淑玲，450001河南省鄭州市，鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;E－mail:wsl5869@163.com

2015－01－18;

2015－08－18)