竇思東，黃清豹，陳 艷，許瑞旭，鄢行輝

（福建中醫(yī)藥大學，福州 350122）

DU20模擬振法對MCAO模型大鼠缺血區(qū)GAP－43表達的影響

竇思東，黃清豹，陳 艷，許瑞旭，鄢行輝*

（福建中醫(yī)藥大學，福州 350122）

目的 觀察“百會”（DU20）模擬振法對局灶性腦缺血大鼠（MCAO）模型中生長相關蛋白-43（GAP-43）表達的變化，探討其對腦缺血早期結構可塑性的影響。方法 采用大鼠大腦中動脈栓塞法制成MCAO模型，研究缺血后1、7、14 d缺血區(qū)GAP-43的表達及振法對其影響。結果 各組大鼠在不同時間段GAP-43表達的比較:1）在造模后第1天，空白對照組和假手術組與其他3組有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），空白對照組、假手術組和模型組與電針組、振法組無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;2）第7天，模型組與空白對照組和假手術組有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），模型組與電針組、振法組有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），空白對照組和假手術組與電針組、振法組有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;3）第14天，模型組與其他3組有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），空白對照組和假手術組與電針組、振法組無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;4）在各個時段，電針組與振法組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），空白組與假手術組無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論 “百會”模擬振法可以提高MCAO模型大鼠GAP-43在缺血區(qū)的表達，對加快腦缺血早期結構可塑性具有一定的影響。

腦缺血;穴，百會;模擬振法;GAP-43

近20年來，大腦神經系統(tǒng)結構與功能的早期可塑性已成為神經生物學研究發(fā)展重要領域［1］。首先，腦的可塑性的含義是指腦神經元之間的突觸、相關蛋白在通過內、外環(huán)境的刺激作用下是可以進行結構重組和功能改變的。神經生長相關蛋白-43（GAP-43）是一種神經元特異性磷蛋白，目前的研究表明其是決定神經元再生、生長和神經結構可塑的內在重要因素之一［2］。針灸推拿治療腦缺血療效確切，但其作用機制特別是對大腦可塑性形成方面的研究有待深入。為此，筆者選擇與大腦早期可塑性關系密切的GAP-43作為檢測指標，觀察模擬振法對MCAO模型大鼠的影響，并探索其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 清潔級健康雄性Sprague Dawley大鼠50只，鼠齡2個月，體質量（300±20）g，分籠飼養(yǎng)于普通級鼠類實驗室，空調調節(jié)室溫（18±2）℃、濕度50% ～60%，通風良好，自由進食與飲水，飼料為全價顆粒飼養(yǎng)［3］。根據《醫(yī)學統(tǒng)計學》中的隨機分組表，隨機分為5組:空白（對照）組、假手術組、模型組、電針治療組、振法治療組，每組各10只。

1.2 模型制作 采用大腦中動脈栓塞法制成局灶性腦缺血（MCAO）模型［3-5］，具體方法:實驗大鼠以10%的水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔麻醉后，仰臥固定于手術臺上，頸部正中碘酒消毒，乙醇脫碘，在頸部正中切開皮膚及淺筋膜，鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌，暴露頸總動脈（CCA）與迷走神經，注意保護頸內動脈（ICA）神經叢，在頸總動脈近心端穿線結扎，提起頸總動脈（CCA），在距離頸內和頸外動脈（ECA）的分叉處遠端約3 mm處剪一小口，用制備好的魚線沿頸總動脈插入頸內動脈，當到達指定長度（18.50±0.50）mm時結扎頸內動脈，結扎遠端，造成左側大腦中動脈供血區(qū)永久性局灶性缺血;然后進行神經血管復位，創(chuàng)口局部撒少許青霉素（約4～6萬u），逐層縫合組織及皮膚。整個造模過程中保溫在38℃左右，防止大鼠術中死亡。術后，動物放回鼠籠中常規(guī)飼養(yǎng)。模型組與治療組制成局灶性腦缺血模型，假手術組只進行雙側頸總動脈分離即縫合。

1.3 治療方法 空白組、假手術組和模型組不加任何干預措施，治療組在造模成功后的次日分別進行電針與振法的治療，取督脈百會穴（定位:當頭部正中線與兩耳尖連線的交點處）［6］，持續(xù)時間為20 min，1次/d，連續(xù)14 d。各組分別在第1天取3只，第7天取3只和第14天取4只，在治療結束后進行免疫組化法對GAP-43表達的觀察。

模擬振法組:用振動按摩治療儀（JH3450）（浙江省金華市錦輝實業(yè)有限公司）進行刺激［7］，用腦立體定位儀將振動儀固定于百會穴處，輕貼皮膚，強度以大鼠頭部輕微抖動為度，輸出峰值電壓4～6 V，刺激頻率50 Hz。

電針組:采用韓氏穴位神經刺激儀（HANSLH202H型）（南京濟生醫(yī)療科技有限公司），以1寸毫針（0.3 mm×25 mm，蘇州醫(yī)療用品廠生產）平刺百會穴0.5寸，采用疏密波，頻率2/15 Hz，強度1 mA，一端電極接在百會穴，一端接在左前肢，強度以頭部和左前肢輕微抖動為度。

1.4 免疫組化 實驗結束后，稱量大鼠的體質量，用10%水合氯醛0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉動物，固定于手術臺，迅速打開胸腔，將灌注針頭迅速插入左心室并進入主動脈，用剪刀在右心耳切口，快速灌注生理鹽水大約250 mL，使灌注液體由此切口流出，以流出液體澄清為度。灌注完后迅速打開顱腔取出完整的腦組織，去掉小腦和低位腦干，在缺血區(qū)做連續(xù)冠狀切片，片厚約2 mm，將組織置于4%多聚甲醛液（4℃）中放入冰箱后固定48 h。再石蠟包埋，切片，片厚約8 μm，裱片于預先涂有多聚賴氨酸的載玻片上，60℃烘箱烤片2～5 h。

1.5 圖像觀察內容及方法 圖像分析GAP-43用光學顯微鏡（生物顯微鏡，Olympus BS-50型，日本Olympus公司生產，福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院重點實驗室提供）確定GAP-43免疫反應產物它們標記的部位。應用Motican 5000C+Moticmed數碼顯微圖像采集與分析系統(tǒng)攝片，Motic Images Advanced 6.0醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)測定梗死周圍區(qū)的吸光值（A值），用A值進行比較分析，以避免非特異性染色所造成的誤差，每例標本被檢各區(qū)測3張切片，求其平均值。

2 結果

各組大鼠在不同時間段生長相關蛋白-43（GAP-43）表達的比較，見表1，圖1。

表1 各組大鼠不同腦梗死區(qū)皮質GAP-43吸光值（A值）的比較（±s，n=10）

表1 各組大鼠不同腦梗死區(qū)皮質GAP-43吸光值（A值）的比較（±s，n=10）

注:與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 術后第1天 術后第7天 術后第14天空白組 0.33 ±0.03△△ 0.34±0.04△△ 0.32±0.03△假手術組 0.42 ±0.05## 0.35 ±0.05## 0.34 ±0.04#模型組 2.80 ±0.23## 2.25 ±0.19## 1.74 ±0.05#電針組 2.33 ±0.18## 1.01 ±0.10#△ 0.42±0.03△振法組 2.43 ±0.17## 1.04 ±0.12#△ 0.37±0.04△

圖1 各組大鼠GAP-43表達比較直方圖

實驗表明，在大鼠腦缺血后，大鼠大腦內神經生長相關蛋白-43（GAP-43）表達明顯提高，第1天假手術組與其他3組的GAP-43的表達比較有顯著差異性，從7～14 d，GAP-43表達逐漸降低，振法組與電針組較模型組有明顯差異。

3 討論

振法是中醫(yī)推拿的特色手法之一，具有活血祛瘀，通經活絡的作用，是一種臨床應用相當廣泛的推拿手法［8］。竇思東等［9］研究認為“百會”穴模擬振法能有效改善受損腦組織及神經細胞的的電生理活動，從而促進腦部的血液循環(huán)，改善大腦功能的恢復。韓廣順［10］認為通過振法能有效的促進大腦神經血管舒縮功能失調的恢復，進而改善腦部的供血。國外研究［11］表明，通過振法能促進腦缺血大鼠大腦內的NMDA受體、分裂素活化蛋白激酶及一氧化氮合酶神經元的表達等相關蛋白因子產生影響，從而促進了腦的早期結構可塑性。

神經生長相關蛋白-43（GAP-43）是一種神經元特異性磷蛋白，通過目前的研究表明其是決定神經元再生、生長和神經結構可塑的內在重要因素之一，研究［2］報道，在損傷神經元內，GAP-43的表達影響著神經細胞的再生能力，提示在腦缺血后的一定時期梗死灶周圍有反應性的神經結構重組表現(xiàn)。研究［12］表明GAP-43與神經再生密切相關，被認為是神經元生長發(fā)育、重組和可塑性的分子標記物;同時以GAP-43表達的升高來提示損傷程度，是大腦神經結構可塑性研究的重要指標。

實驗證明模擬振法能有效的激發(fā)病變區(qū)域受損傷、冬眠或頓挫導致營養(yǎng)缺失的腦神經細胞，使其病變區(qū)域腦血流灌注或腦缺血再灌注增高，提高損傷區(qū)域神經GAP-43的表達，加快修復大腦損傷的神經和結構功能，進一步促進大腦早期腦結構功能的恢復。

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DU20 vibration method on expression of GAP-43 in ischemic of MCAO rats

DOU Sidong，HUANG Qingbao，CHEN Yan，XU Ruixu，YAN Xinghui*
（Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350122，China）

ObjectiveTo observe the DU20 vibration method in rats with focal cerebral ischemia（MCAO）changes of growth associated protein-43（GAP-43）expression in the model，and discusses the effects of structural plasticity early on cerebral ischemia.MethodsUsing the legal system into MCAO rat model of middle cerebral artery occlusion，ischemia after 1 days，days and 14 days in ischemic area of the expression of GAP-43 and the effects of vibration method.ResultsAll the rats at different time periods of GAP-43 expression in comparison:first days after modeling，control group and sham operation group and the other three groups hadsignificant difference（P ＜0.01），the blank group，sham operation group and model group and the electroacupuncture group，no vibration method significant difference（P ＞0.05）;the seventh day，model group and blank group and sham operation group have significant difference（P ＜0.01），there are obvious differences in the model group and the（JA08113 electroacupuncture group，vibration method group（P ＜0.05），control group and sham operation group and the electroacupuncture group were significantly，vibration method the difference（P ＜0.05）;the fourteenth day，the model group and the other three groups had significant difference（P ＜0.05），control group and sham operation group and electroacupuncture group，vibration method groups had no significant difference（P ＞0.05）;in each period，the electro acupuncture group and the vibration method group had no significant difference（P ＞0.05）.No blank group and sham operation group were significantly different（P ＞0.05）.Conclusion“Baihui”vibration method can improve the rat MCAO model GAP-43 expression in the ischemic area，to accelerate structural plasticity of early cerebral ischemia has some influence.

cerebral ischemia;point，Baihui，DU20;simulation method of vibration;GAP-43

R245.3

A

2095－6258（2015）04－0680－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2015.04.007

福建省教育廳資助課題項目“振法對腦缺血大鼠SEP和早期結構可塑性影響的研究”（JA08113）。

竇思東（1960－），男，副教授，碩士研究生導師，主要從事針灸推拿的基礎與臨床研究。

鄢行輝，男，教授，電話－13328218821，電子信箱－13328218821@163.com

2014－12－15）