蔣刈　籍靈超　李北成　戴樸　韓東一*解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京00480）2福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)系、福建省立醫(yī)院耳鼻咽喉科（福州35000）

·綜述·

基因治療技術(shù)的發(fā)展在耳聾功能及治療研究方面的應(yīng)用

蔣刈1、2籍靈超1李北成1戴樸1韓東一1*
1解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100480）
2福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)系、福建省立醫(yī)院耳鼻咽喉科（福州350001）

基因治療是指將外界正?；蛑委熁?，通過載體轉(zhuǎn)移到人體的靶細(xì)胞，進(jìn)行基因修飾和表達(dá)，從而改善疾病的一種治療手段?；蛑委煹母拍钭钤缡窃?972年由Friedmann和Roblin提出［1］。既往以同源重組（Homologous Recombination，HR）修復(fù)機(jī)制為基礎(chǔ)的基因打靶（gene targeting）技術(shù)在研究基因功能方面發(fā)揮重要作用并用于基因治療的探索。近幾年基于同源重組修復(fù)機(jī)制和不依賴于同源重組的非同源末端連接（Non Homologous End Joining，NHEJ）機(jī)制的基因組編輯（genome editing）技術(shù)開創(chuàng)了基因研究及治療的新天地。

1　基因打靶技術(shù)的發(fā)展

基因打靶是應(yīng)用同源重組的原理，在胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ES）技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，將外源性DNA定點(diǎn)修飾改造染色體目的基因的方法，包括基因敲除（knock out）和基因敲入（knock in）技術(shù)?；虼虬泻蠖ㄏ蚋淖兗?xì)胞或者生物個(gè)體遺傳信息并使修飾后的遺傳信息通過生殖系遺傳，表達(dá)突變的性狀，已成為一種較理想的改造生物遺傳物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)方法。

20世紀(jì)70年代在釀酒酵母中得以應(yīng)用的基因敲除技術(shù)［2］和20世紀(jì)80年代早期建立的胚胎干細(xì)胞技術(shù)［3］為基因打靶提供了基礎(chǔ)。1985年，Smithies等［4］首次在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行的基因打靶，將一段外源質(zhì)粒利用同源重組技術(shù)插入到人染色體的β-球蛋白位點(diǎn)基因間。1987年，Smithies［5］和Capecchi MR［6］兩個(gè)研究小組同時(shí)報(bào)道在小鼠ES細(xì)胞中進(jìn)行基因敲除。此后，基因敲除的小鼠ES細(xì)胞研究蓬勃發(fā)展，現(xiàn)已成為研究基因結(jié)構(gòu)功能和建立人遺傳性疾病模型的一種常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法。1981年Sternberg從Pl噬菌體中發(fā)現(xiàn)Cre-LoxP系統(tǒng)，1994年，Zimmer等［7］首次應(yīng)用Cre-LoxP系統(tǒng)研制的組織特異性基因敲除小鼠問世以后，條件基因敲除技術(shù)迅速取代了傳統(tǒng)的完全基因敲除而成為主流［8］。條件基因敲除技術(shù)利用Cre-LoxP系統(tǒng)和FLP-FRT系統(tǒng)，用在特定階段特定組織或細(xì)胞中表達(dá)Cre或FLP重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠與在基因組中引入LoxP或FRT序列的小鼠交配，可導(dǎo)致子代鼠中特定組織或細(xì)胞中的靶基因刪除?；虼虬卸嘤糜谛∈驟S細(xì)胞研究，所建立的小鼠模型包括癌基因和腫瘤抑制基因、免疫相關(guān)基因、生長因子與受體基因等［9-13］，多與人類遺傳性疾病有關(guān)。

體細(xì)胞克隆技術(shù)的發(fā)展使得利用克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物成為科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)。1997年，Schnieke等［14］首次將凝血因子Ⅸ基因用脂質(zhì)體包埋法轉(zhuǎn)染胚胎成纖維細(xì)胞，篩選的陽性細(xì)胞進(jìn)行核移植，獲得轉(zhuǎn)基因克隆羊“Polly”，是這項(xiàng)技術(shù)的標(biāo)志。之后通過核移植生產(chǎn)的體細(xì)胞基因打靶綿羊［15］、敲除α-1，3-半乳糖苷酶基因的克隆豬［16］都獲得了成功。2007年10月8日，美國科學(xué)家Mano R.Capecchi，Oliver Smithies和英國科學(xué)家Martin J.Evans因?yàn)樵凇盎虼虬屑夹g(shù)”方面的奠基性貢獻(xiàn)分享了該年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。2007年，日本科學(xué)家利用臉部細(xì)胞［17］和美國科學(xué)家利用新生兒包皮細(xì)胞［18］均成功制成了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS），被《自然》和《科學(xué)》分別評為2007年第一和第二大科學(xué)進(jìn)步。

隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，早期技術(shù)中的許多不足和缺陷多已經(jīng)解決，但始終存在著難以克服的缺點(diǎn)：即基因功能與表型分離和基因敲除致死性，導(dǎo)致無法對這些相應(yīng)的基因進(jìn)行研究［19］。

2　基因打靶技術(shù)在遺傳性耳聾基因功能研究及治療方面運(yùn)用

基于同源重組技術(shù)和胚胎干細(xì)胞技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的基因打靶、條件基因敲除和體細(xì)胞克隆技術(shù)，已廣泛運(yùn)用于內(nèi)耳發(fā)育及內(nèi)耳基因功能研究中，這些基因主要是通過編碼轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道或神經(jīng)遞質(zhì)受體蛋白等重要的生物分子調(diào)控內(nèi)耳發(fā)育［20-36］。（見表2、表3）

表2　基因打靶與部分內(nèi)耳相關(guān)基因功能研究

在耳聾基因治療領(lǐng)域，1996年，Lalwani等［37］將遺傳物質(zhì)直接導(dǎo)入外周聽系，開啟了對感音神經(jīng)性耳聾基因治療的探索。2005年，Sage等［38］通過在RB1基因條件敲除小鼠內(nèi)耳重新恢復(fù)RB1基因功能獲得功能性毛細(xì)胞的再生。同年，Izumikawa等［39］利用腺病毒載體將Atoh1基因?qū)胨幬镄灾旅@豚鼠內(nèi)耳，觀察其聽力得到改善，受損的部分毛細(xì)胞得到恢復(fù)甚或產(chǎn)生新的毛細(xì)胞。2012年，Lustic等［40］通過腺病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)使Vglut3基因敲除小鼠恢復(fù)聽力。2013年，Lentz等［41］利用糾正前體mRNA剪接缺陷的反義寡核苷酸（ASO）對新出生的Usher綜合征小鼠模型進(jìn)行經(jīng)腹腔注射，使小鼠低頻聽力提高、前庭功能改善。但ASO治療策略只在發(fā)育早期階段（P5-P10）有效，并且效果短暫，限制了它在人類的應(yīng)用。2014年，Yu等［42］通過直接注射方式，將外源性Gjb2基因?qū)隚jb2基因敲除的小鼠模型后發(fā)現(xiàn)該基因編碼的Cx26表達(dá)于內(nèi)耳支持細(xì)胞系統(tǒng)，縫隙連接通道形成，但模型小鼠的聽力沒有改善。2015年，Charles Askew等［43］運(yùn)用腺相關(guān)病毒載體對Tmc1基因缺失小鼠進(jìn)行治療，在隱性遺傳耳聾小鼠模型中檢測到聲音刺激下毛細(xì)胞電流感知，在顯性遺傳小鼠模型中部分恢復(fù)小鼠功能并持續(xù)2個(gè)月。這是基因治療遺傳性耳聾方面的重大突破，然而研究手段制備動(dòng)物模型周期長、效率低、有不同程度細(xì)胞致死性以及不可預(yù)知的脫靶情況，仍然限制了科學(xué)家們在探索基因型和表型關(guān)系的科研道路上前進(jìn)的步伐［44］。安全和有效的基因治療手段來實(shí)現(xiàn)基因缺陷性小鼠模型的聽功能修復(fù)是研究者探尋的目標(biāo)。

3　基因技術(shù)新進(jìn)展--基因組編輯技術(shù)

近年來興起了新一代基因組編輯技術(shù)，包括：鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和成簇可調(diào)控間隔短回文重復(fù)RNA引導(dǎo)核酸酶（clustered regulatory interspaced shortpalindromicrepeatsCRISPR/Cas-based RNA-guided DNA endonucleases，CRISPR/Cas）。從分子生物學(xué)角度上說此三項(xiàng)技術(shù)均屬于基因定點(diǎn)修飾技術(shù)，本質(zhì)上均利用依賴于同源重組（HR）的修復(fù)機(jī)制和不依賴于同源重組的非同源末端連接（NHEJ）機(jī)制，聯(lián)合特異DNA靶向識(shí)別及核酸內(nèi)切酶完成DNA序列改變。新一代基因組編輯技術(shù)可實(shí)現(xiàn)基因組任意位置的基因敲除（knock out）、刪除（deletion）或外源基因敲入（knock in）、基因融合（gene integration），進(jìn)行生物基因組改造、基因功能分析、動(dòng)植物育種抗病研究。此類技術(shù)以高效率、高精確度對基因組進(jìn)行人工修飾，對目的基因組操作的效率較同源重組技術(shù)有明顯的提高，敲除效果更加徹底，并且降低了脫靶情況［45，46］。

ZFNs技術(shù)和TALENs技術(shù)均是通過與Fok I非特異性核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域形成異源二聚體完成特定位點(diǎn)剪切。因不需要通過ES細(xì)胞打靶環(huán)節(jié)，可以直接通過原核注射的方式實(shí)現(xiàn)目的基因的編輯，極大的縮短了建立基因敲除動(dòng)物模型的時(shí)間，拓寬了基因修飾的物種范圍。主要不同是構(gòu)建靶點(diǎn)識(shí)別模塊方式：ZFNs技術(shù)由特異性識(shí)別序列的鋅指DNA結(jié)合域和Fok I切割結(jié)構(gòu)域兩部分組成的蛋白核酸酶實(shí)現(xiàn)內(nèi)源基因的定點(diǎn)修飾。鋅指DNA結(jié)合域部分一般包含3個(gè)重復(fù)的獨(dú)立鋅指結(jié)構(gòu)，每個(gè)鋅指能夠識(shí)別3個(gè)堿基因，一個(gè)鋅指DNA結(jié)合域可以識(shí)別9bp長度的特異性序列，而ZFN二聚體包含6個(gè)鋅指，可以識(shí)別18bp長度特異序列。因ZFN技術(shù)實(shí)現(xiàn)了人類培養(yǎng)細(xì)胞系中ZFN介導(dǎo)的基因敲除［47］和基因定點(diǎn)敲入［48］。被《科學(xué)》雜志評為2009年生命科學(xué)領(lǐng)域十大創(chuàng)新技術(shù)之一。TALENs技術(shù)是根據(jù)目標(biāo)DNA序列構(gòu)建一對TAL靶點(diǎn)識(shí)別模塊與N端的核定位序列、C端的Fok I酶連接，得到完整的TALEN元件。天然的TALEN元件識(shí)別的特異性DNA序列長度一般為17-18bp，而人工TALEN元件識(shí)別的特異性DNA序列長度一般為14-20bp。TALEN最少可識(shí)別1個(gè)堿基數(shù)量。TALEN技術(shù)自從2009年Moscou等［49］破解了Tale蛋白能夠特異性識(shí)別和結(jié)合宿主DNA的作用機(jī)制及2011年Cermak［50］進(jìn)行人工Tale蛋白的改造后，已經(jīng)逐漸成為基因組定點(diǎn)靶向修飾的主要技術(shù)，開啟人類多功能干細(xì)胞進(jìn)行定向的基因操作探索，《科學(xué)》雜志在2012年度評論中將TALEN技術(shù)比作基因組的“巡航導(dǎo)彈”。

表3　基因打靶與部分綜合征性耳聾基因功能研究

CRISPR/Cas系統(tǒng)［51］由Cas蛋白基因、前導(dǎo)序列和主體CRISPR基因座共同構(gòu)成。根據(jù)作用機(jī)制中Cas蛋白基因的差異性將CRISPR系統(tǒng)分為3種類型，在II型CRISPR系統(tǒng)中，主要利用Cas9：sgRNA復(fù)合體作為基因組編輯工具。其中Cas9蛋白具有核酸內(nèi)切酶功能，sgRNA（Single guide RNA）嵌合體由三部分組成：一段回文序列形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)為Cas9蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，由crRNA-tracRNA改造而成，一段長度約為12-20bp與目標(biāo)DNA互補(bǔ)的RNA單鏈序列（basepairing region）以及一段終止序列（terminator）。crRNA（CRISPR RNA）通過堿基對連接反式編碼小RNA（trans-encoded small RNA，tracrRNA）形成的二元RNA結(jié)構(gòu)能指導(dǎo)Cas9蛋白對幾乎所有DNA序列進(jìn)行剪切。與ZFN和TALENs相比，CRISPR-Cas9在操作的簡便性、實(shí)驗(yàn)周期、效率等方面更有優(yōu)勢，具體表現(xiàn)在①無物種限制，靶向精確性更高，可實(shí)現(xiàn)對靶基因多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)敲除；②使用方便，費(fèi)用低廉；③CRISPR/Cas系統(tǒng)只需改變很短的RNA序列（不超過100bp）就可實(shí)現(xiàn)不同位點(diǎn)的特異性識(shí)別，可避免超長、高度重復(fù)的TALENs編碼載體帶來的并發(fā)癥［52］。2013年多篇關(guān)于利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)在多種動(dòng)植物內(nèi)［53-56］進(jìn)行多重基因組重組編輯的報(bào)道，開啟了第三代人工核酸酶成為研究熱點(diǎn)的新篇章，而《Nature》將通過CRISPR/Cas9技術(shù)獲得世界首例基因敲除食蟹猴的成果，稱為人類疾病模型發(fā)展的里程碑［57］。

4　基因組編輯技術(shù)在遺傳性耳聾基因功能研究及治療方面運(yùn)用

目前基因組編輯技術(shù)在內(nèi)耳基因功能研究方面開展剛剛起步，2014年，Nagel-Wolfrum等［58］在研究Usher綜合征的p.R31X基因突變中，運(yùn)用ZFN技術(shù)將病變處雙鏈斷裂，重組正常的基因片段修復(fù)病變。2015年，F(xiàn)rancis等［59］運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)改變了Xin-actin binding repeat containing（XIRP2）表達(dá)，導(dǎo)致小鼠高頻聽力下降，并發(fā)現(xiàn)XIRP2在靜纖毛長期功能保持中發(fā)揮作用。由于基因組編輯技術(shù)可用于生殖細(xì)胞、內(nèi)耳毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的研究，2015年，Zuris等［60］在Atoh1-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠耳蝸調(diào)控Atoh1功能使外毛細(xì)胞高表達(dá)GFP，利用陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)RNAiMAX/Lipofectamine將具有靶向基因修飾作用Cas9：sRNA直接注入小鼠耳蝸后，在原表達(dá)GFP的外毛細(xì)胞出現(xiàn)明顯的GFP缺失。這是首次運(yùn)用CRISPR/cas9技術(shù)把蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合體直接成功地傳遞到哺乳動(dòng)物組織體內(nèi)并實(shí)現(xiàn)的基因組編輯的重大事件，證實(shí)這項(xiàng)技術(shù)可用于遺傳性聽力損失小鼠模型聽力恢復(fù)，是從基因水平糾正耳蝸局部致病突變的首次成功探索。

CRISPR/Cas技術(shù)在遺傳性耳聾治療方面應(yīng)用潛力巨大。同時(shí)，在眾多基因組編輯技術(shù)中，該技術(shù)優(yōu)勢明顯，是遺傳學(xué)研究領(lǐng)域的未來發(fā)展趨勢。將CRISPR/Cas這一前沿技術(shù)應(yīng)用于內(nèi)耳研究，實(shí)現(xiàn)對遺傳性耳聾基因的靶向編輯、糾正突變，將為耳聾治療帶來新的希望。

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R764.43

A

1672-2922（2015）04-750-5

2015-11-3審核人：郭維維）

10.3969/j.issn.1672-2922.2015.04.045

國家自然基金重點(diǎn)項(xiàng)目（81230020）；國家自然基金面上項(xiàng)目（81371096）

蔣刈，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：耳科學(xué)及耳聾基因

韓東一，Email：hdy301@263.net