牛紅鑫等

摘要：以殼聚糖為載體固定化胰蛋白酶，制備牡蠣肽，然后以肽得率為指標(biāo)，分別研究了pH值，酶加量，酶解時(shí)間和溫度等單因子對(duì)固定化胰蛋白酶酶解牡蠣蛋白質(zhì)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酶解牡蠣蛋白的最佳工藝條件是：底物濃度為200 μg/mL，加固定化胰蛋白酶量7 mg/3 mL，酶解時(shí)間3 h，pH 8.0，溫度40 ℃。在此條件下水解牡蠣蛋白，肽得率可達(dá)到20.39%。

關(guān)鍵詞：殼聚糖；固定化；胰蛋白酶；牡蠣；肽

牡蠣（Crassostrea gigas）是我國(guó)重要的養(yǎng)殖貝類品種。牡蠣具有豐富的營(yíng)養(yǎng)，還有一定的藥用價(jià)值。近年的研究表明，牡蠣肽具有多種多樣的生物活性。Wang等利用枯草桿菌蛋白酶從牡蠣中制備的牡蠣肽具有抗氧化活性，經(jīng)過(guò)HPLC分離獲得了抗氧化活性牡蠣肽PVMGD和QHGV[1]。其它的還有刺激免疫細(xì)胞增加IL-2作用、抑制ACE酶活性以及抗菌活性[2-4]。因此牡蠣肽是一種重要的生物活性物質(zhì)，可以應(yīng)用于保健食品領(lǐng)域。

酶解法是制備肽的常用方法，固定化酶的方法也是常用的酶解工藝[5]。固定化酶具有可以重復(fù)使用、生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)。本文以肽得率為指標(biāo)，研究利用殼聚糖固定化胰蛋白酶制備牡蠣肽的最佳工藝條件。研究結(jié)果將為牡蠣肽的制備提供一些有益的數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

牡蠣購(gòu)于大連長(zhǎng)興農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

胰蛋白酶（1：250）購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；殼聚糖購(gòu)于浙江金殼生物化學(xué)有限公司。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2方法

1.2.1固定化胰蛋白酶的制備按張金鈴等的方法進(jìn)行殼聚糖固定胰蛋白酶的制備[5]。在0.2 g殼聚糖上固定了20 mg的胰蛋白酶，活力為314 U。

1.2.2牡蠣肽的制備取新鮮牡蠣，去除內(nèi)臟，加入0.9%的NaCl溶液并進(jìn)行勻漿，置于4 ℃抽提過(guò)夜。在4 000 r/min條件下離心20 min，獲得上清液。

將一定量的殼聚糖固定胰蛋白酶加入到上清液中進(jìn)行酶解，在不同底物濃度、溫度、pH、加固定化胰蛋白酶量以及時(shí)間等條件下，測(cè)定肽得率。

1.2.3肽得率測(cè)定采用Folin-酚法測(cè)定上清液中的蛋白含量。酶解液經(jīng)三氯乙酸（TCA）沉淀后，上清部分用Folin-酚法測(cè)定，即是肽的含量。肽得率（%）=上清液肽含量/蛋白含量。

2結(jié)果與討論

2.1不同的殼聚糖固定胰蛋白酶加酶量對(duì)牡蠣蛋白酶解反應(yīng)的影響

在pH8.0的3 mL底物質(zhì)量濃度為200 μg/mL的牡蠣蛋白溶液中，分別加入3、4、5、6、7、8 mg固定化胰蛋白酶，于40 ℃水浴酶解4 h，測(cè)得的固定化胰蛋白酶酶解牡蠣蛋白結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著固定化胰蛋白酶量的增加，肽得率逐漸升高，且在固定化胰蛋白酶用量為6 mg/3 mL后，肽得率增加較慢。

2.2pH對(duì)牡蠣蛋白酶解反應(yīng)的影響

在pH分別為5、6、7、8的3 mL底物質(zhì)量濃度為200 μg/mL的牡蠣蛋白溶液中，各加入6 mg固定化胰蛋白酶，于40 ℃水浴酶解4 h，測(cè)得的固定化胰蛋白酶酶解牡蠣蛋白結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著pH值的增加，肽得率先升高后降低，且在pH值為8時(shí)，肽得率最大。

2.3溫度對(duì)牡蠣蛋白酶解反應(yīng)的影響

在pH 8.0的3 mL底物質(zhì)量濃度為200 μg/mL的牡蠣蛋白溶液中，加入6 mg固定化胰蛋白酶，分別于25、30、35、40、45、50、55 ℃水浴酶解4 h，測(cè)得的固定化胰蛋白酶酶解牡蠣蛋白結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著酶解溫度的增加，肽得率先升高后降低，且在溫度值為40 ℃，肽得率最大。

2.4底物濃度對(duì)牡蠣蛋白酶解反應(yīng)的影響

在pH 8.0的3 mL底物質(zhì)量濃度分別為100、150、200、250、300 μg/mL的牡蠣蛋白溶液中，加入6 mg固定化胰蛋白酶，于40 ℃水浴酶解4 h，測(cè)得的固定化胰蛋白酶酶解牡蠣蛋白結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著底物濃度的增加，肽得率逐漸升高，且在底物質(zhì)量濃度為200 μg/mL后，肽得率增加較慢。

2.5酶解時(shí)間對(duì)菲律賓蛤仔酶解反應(yīng)的影響

在pH 8.0的3 mL底物質(zhì)量濃度為200 μg/mL的牡蠣蛋白溶液中，加入6 mg固定化胰蛋白酶，于40 ℃分別水浴酶解1、2、3、4、5、6 h，測(cè)得的固定化胰蛋白酶酶解牡蠣蛋白結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，肽得率逐漸升高，且在3 h后，肽得率增加較慢。

2.6殼聚糖固定胰蛋白酶最佳水解條件的確定

影響酶解反應(yīng)的幾個(gè)主要因素為固定化酶量、酶解時(shí)間、pH、溫度和底物濃度。根據(jù)上述單因素試驗(yàn)分析，并考慮生產(chǎn)成本等因素，酶解溫度40 ℃，底物濃度200 μg/mL，以肽得率為指標(biāo)做殼聚糖固定胰蛋白酶量、pH、酶解時(shí)間3因素3水平的正交試驗(yàn)L9 （33 ），正交試驗(yàn)的因素水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

1.32由表2可知，各因素對(duì)殼聚糖固定胰蛋白酶酶解菲律賓蛤仔蛋白的肽得率影響大小順序?yàn)锳>B>C，即：酶加量>pH>酶解時(shí)間，最優(yōu)水平為A3B3C2，即：pH為8.0，殼聚糖固定胰蛋白酶量為7 mg/3 mL，酶解時(shí)間3 h。

因此確定殼聚糖固定胰蛋白酶酶解菲律賓蛤仔低分子量蛋白的最佳條件為酶加量7 mg/3 mL，時(shí)間3 h，pH 8.0，溫度40 ℃，底物濃度為200 μg/mL。在此條件下水解牡蠣蛋白，肽得率可達(dá)到20.39%。

3結(jié)論

殼聚糖固定胰蛋白酶酶解牡蠣蛋白的最佳條件為酶加量7 mg/3 mL，時(shí)間3 h，pH 8.0，溫度40 ℃，底物濃度為200 μg/mL。在此條件下水解牡蠣蛋白，肽得率可達(dá)到20.39%。

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