馬 森，張恩平＊，陳玉林＊，閆海龍

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100；2.榆林學(xué)院生命科學(xué)研究中心，陜西 榆林719000）

山羊絨是絨山羊次級(jí)毛囊的產(chǎn)物，又稱開(kāi)司米，是極好的紡織原料。不同顏色絨毛中，又以白絨最為珍貴［1］。山羊絨隨絨山羊皮膚內(nèi)次級(jí)毛囊周期性在生長(zhǎng)期、退行期及休止期間定向轉(zhuǎn)換而循環(huán)生長(zhǎng)、著色及脫落［2］。因此探索山羊絨周期再生及著色的分子機(jī)理，將對(duì)絨山羊遺傳育種及羊絨產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有促進(jìn)作用。

Wnt／β－catenin 信 號(hào) 通 路 是 由 Nusse 等［3］于1982年在小鼠乳腺腫瘤病毒研究中首次發(fā)現(xiàn)的，其傳導(dǎo)途徑如下：Wnt蛋白與靶細(xì)胞膜受體結(jié)合而激活胞質(zhì)內(nèi)小分子β－catenin，促使其在胞質(zhì)內(nèi)聚集后轉(zhuǎn)位入核，激活轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物L(fēng)ef1／Tcf3而起始下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。此外，一些拮抗因子如Dkk1［4］等能通過(guò)與Wnt蛋白競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合膜受體而抑制該信號(hào)通路。

國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，Wnt／β－catenin信號(hào)通路是調(diào)控成熟毛囊周期性發(fā)育的中樞通路之一，該通路內(nèi)β－catenin等上游基因在毛囊周期性發(fā)育過(guò)程中起著決定性作用［5］。β－catenin、Lef1／Tcf3等基因突變失活阻礙成熟毛囊再次進(jìn)入周期性發(fā)育過(guò)程，而其過(guò)表達(dá)則誘導(dǎo)成熟毛囊提前由休止期向生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)換［6］。同時(shí)，β－catenin 等基因也能夠促進(jìn)生長(zhǎng)中期毛囊內(nèi)部細(xì)胞的大量增殖分化而快速重構(gòu)毛干［7］。Dkk1基因的過(guò)表達(dá)則阻斷毛囊周期性再生的過(guò)程。此外，β－catenin、Lef1／Tcf3及 Dkk1也參與調(diào)控毛囊內(nèi)部黑素細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育及黑素合成的過(guò)程而影響毛干的著色［8］。

目前，Wnt／β－catenin信號(hào)通路調(diào)控成熟毛囊周期性發(fā)育及毛干著色過(guò)程的研究主要集中在人和小鼠上，而在絨山羊上則尚有相關(guān)研究報(bào)道。本研究擬對(duì)該通路上游基因β－catenin、Lef1／Tcf3及拮抗基因Dkk1mRNA在白色絨山羊絨毛生長(zhǎng)不同時(shí)期及黑、白色絨山羊絨毛生長(zhǎng)旺盛期時(shí)體側(cè)部皮膚組織中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，初步探究 Wnt／β－catenin信號(hào)通路是否參與山羊絨周期性再生及著色的過(guò)程，為進(jìn)一步完善山羊絨毛周期性再生及著色的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于榆林市陜北白絨山羊繁育中心選取成年黑、白色供試公羊3只，于2013年5月至2014年3月每間隔兩月采取體側(cè)部皮膚組織1cm2，共采集六次（黑色絨山羊只采集9月份皮膚樣品）。皮膚組織離體后，置于DEPC處理過(guò)的生理鹽水中沖洗血液及其他雜物，立即將皮膚組織置于RNA保存液中，低溫運(yùn)輸，－80℃保存。

1.2 主要試劑與儀器

RNA保存液（Takara）、RNA提取試劑盒（康為世紀(jì)）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Scientific）、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（Takara）、膠回收試劑盒（Omega）。梯度PCR儀（Bio－Rad），pMD－19T克隆載體（Takara）；核酸蛋白定量?jī)x（NanoDrop）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio－Rad）；凝膠電泳儀（北京六一儀器廠）；凝膠成像儀（Bio－Rad）；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf）。

1.3 皮膚組織總RNA提取及cDNA合成

皮膚組織解凍后經(jīng)DEPC處理水吹洗三次以除去殘留RNA保存液，經(jīng)高通路組織研磨器研磨后按照超純RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)所示步驟提取皮膚組織總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提總RNA完整性，核酸定量?jī)x測(cè)定總RNA純度及濃度。

將所提取的皮膚組織總RNA均質(zhì)化然后依照Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明書(shū)所示步驟以O(shè)ligo（dT）18為引物進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。反應(yīng)體系如下：2μg總RNA、1μL Oligo（dT）18引物、4 μL 5XReaction Buffer、1μL RibolLock RNase Inhibitor（20u／μL）、2μL 10mM dNTP Mix、1μL RevertAid M－MuLV Reverse Transcriptase（200u／μL），補(bǔ)足無(wú)酶水至20μL。上述試劑配置均在冰上進(jìn)行。輕微混勻后離心，42℃孵育60min，70℃加熱5min終止反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 Wnt／β－catenin信號(hào)通路上游基因 mRNA 在白色絨山羊不同時(shí)期體側(cè)部皮膚組織的表達(dá)

據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的β－catenin（XM＿005695574.1）、Dkk1（XM＿005698161.1）、Tcf3（XM＿005682921.1）、Lef1（NM＿001285746.1）及內(nèi)參基因β－actin（XM＿005946208.1）核苷酸序列，采用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)定量引物。實(shí)時(shí)熒光定量確定引物的擴(kuò)增特異性及效率。各基因引物見(jiàn)表1。

表1 Wnt／β－catenin信號(hào)通路上游基因?qū)崟r(shí)熒光定量引物Table 1 Primers sequences of upstream genes within Wnt／β－catenin pathway for quantitative real－time PCR

取反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈，使用上述各基因引物進(jìn)行qRT－PCR條件及體系的優(yōu)化。優(yōu)化后的反應(yīng)體系如下：12.5μL SYBR?Premix Ex TaqII（Tli RNaseH Plus）2×、1μL PCR Forward Primer（10μM）、1μL PCR Reverse Primer（10 μM）、cDNA 2μL、滅菌ddH2O 8.5μL，總體積為25μL。實(shí)時(shí)定量采用三步法PCR程序：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，58℃退火30s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；60～95℃解鏈，梯度0.5℃，共71個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品做三次重復(fù)。

1.5 Wnt／β－catenin通路上游基因 mRNA 在生長(zhǎng)旺盛期黑白色絨山羊體側(cè)部皮膚組織的表達(dá)

β－catenin、Lef1／Tcf3及 Dkk1基因所采用實(shí)時(shí)熒光定量引物及反應(yīng)條件同1.5。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

相關(guān)基因在白色絨山羊絨毛生長(zhǎng)不同時(shí)期及生長(zhǎng)旺盛期黑、白色絨山羊體側(cè)部皮膚組織中的相對(duì)表達(dá)量采用2－ΔΔCt法計(jì)算。各基因在不同月份白色絨山羊皮膚組織中的相對(duì)表達(dá)量以5月份為基準(zhǔn)，而9月份黑、白色絨山羊皮膚組織內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量則以黑色為基準(zhǔn)。數(shù)據(jù)顯著性分析采用SPSS 17軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 皮膚組織樣品所提取總RNA檢測(cè)

經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提取的絨山羊皮膚總RNA發(fā)現(xiàn)，OD260／280值均在1.8至2.0之間。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖中28S、18S電泳條帶清晰可見(jiàn)，5S條帶暗淡，各條帶之間彌散較少。結(jié)果表明，所提取皮膚組織總RNA完整性良好，純度及質(zhì)量滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增效率及相關(guān)系數(shù)分析

絨山羊皮膚樣品的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得皮膚樣品cDNA，經(jīng)10倍梯度比稀釋后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到內(nèi)參基因β－actin 及β－catenin 等基因相關(guān)系數(shù)（R）均在0.990以上，擴(kuò)增效率（E）均在95%～110%之間。結(jié)果表明，反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA可用于下一步實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系及條件適于β－actin及β－catenin等基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量研究。

2.3 Wnt／β－catenin信號(hào)通路上游基因在白色絨山羊不同月份體側(cè)部皮膚組織的表達(dá)

Wnt／β－catenin信號(hào)通路上游基因mRNA不同月份間相對(duì)表達(dá)量（5月份為基準(zhǔn)）見(jiàn)圖1。由圖1知，βcatenin、Lef1／Tcf3基因mRNA相對(duì)表達(dá)量在5～9月份間逐步上調(diào)，9月份表達(dá)量最高（P＜0.05）；9月份到次年3月份間，表達(dá)量逐步下調(diào)；3月份表達(dá)量最低（P＜0.05）。同時(shí)，各基因mRNA在5月份的相對(duì)表達(dá)量顯著高于3月份（P＜0.05）。Dkk1作為Wnt／β－catenin信號(hào)通路的拮抗基因，其各月份之間相對(duì)表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，Wnt／β－catenin信號(hào)通路內(nèi)β－catenin等上游基因mRNA在間白色絨山羊各月份體側(cè)部皮膚組織中的相對(duì)表達(dá)量有明顯的先上調(diào)后下調(diào)的變化規(guī)律，而Dkk1基因mRNA各月份間相對(duì)表達(dá)量則無(wú)類似的變化規(guī)律。

圖1 Wnt／β－catenin信號(hào)通路上游基因在白色絨山羊不同月份皮膚組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of upstream genes within Wnt／β－catenin signaling in cashmere goat skin tissue among different months

2.4 Wnt／β－catenin通路上游基因在生長(zhǎng)旺盛期黑白絨山羊皮膚組織中的表達(dá)

Wnt／β－catenin 信號(hào)通路中上游基因β－catenin、Lef1／Tcf3以及該通路拮抗基因Dkk1mRNA在9月份黑、白色絨山羊皮膚組織中的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖2。由圖2可知，各基因mRNA在黑、白絨山羊皮膚組織中的相對(duì)表達(dá)量均差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 Wnt／β－catenin通路上游基因在黑白色絨山羊皮膚組織中的表達(dá)Fig.2 Expression of upstream genes within Wnt／β－catenin signaling in cashmere goat skin tissue between the white and black

3 討 論

研究表明，Wnt／β－catenin信號(hào)通路基因在小鼠皮膚組織中的表達(dá)具有毛囊周期依賴性的特征，即在生長(zhǎng)前期出現(xiàn)表達(dá)，生長(zhǎng)中期表達(dá)量最高，退行期及休止期表達(dá)量最低甚至沒(méi)有表達(dá)［9］。本試驗(yàn)對(duì)Wnt／β－catenin信號(hào)通路上游β－catenin 等基因 mRNA在不同月份白色絨山羊體側(cè)部皮膚組織中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行研究。對(duì)于絨山羊來(lái)講，5、7月份為絨毛生長(zhǎng)前期，9月份為生長(zhǎng)旺盛期，11月份為生長(zhǎng)后期，1月份處于退行期，3月份則處于休止期［10］。Wnt／β－catenin信號(hào)通路上游基因mRNA在處于各個(gè)時(shí)期內(nèi)的白色絨山羊體側(cè)部皮膚組織中均有表達(dá)，生長(zhǎng)前期（5、7月份）至生長(zhǎng)旺盛期（9月份）時(shí)表達(dá)量逐漸升高，旺盛期時(shí)表達(dá)量最高，生長(zhǎng)旺盛期后進(jìn)入生長(zhǎng)后期（11月份）、退行期（1月份）時(shí)表達(dá)量逐漸下調(diào)，休止期（3月份）時(shí)表達(dá)量最低。Wnt／βcatenin信號(hào)通路上游基因在白色絨山羊不同時(shí)期體側(cè)皮膚中的表達(dá)呈現(xiàn)同絨毛周期生長(zhǎng)同步的規(guī)律性，表明該信號(hào)通路同次級(jí)毛囊的活動(dòng)密切相關(guān)。

Wnt／β－catenin信號(hào)通路在毛囊生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用主要與毛囊內(nèi)部各類細(xì)胞增殖、分化有關(guān)。毛囊形態(tài)發(fā)生期時(shí)，Wnt／β－catenin信號(hào)首先在真皮中出現(xiàn)，構(gòu)成“第一真皮信號(hào)”，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞聚集增殖形成表皮基板以及真皮凝聚物［11］。隨后，Wnt／βcatenin信號(hào)作為“第二真皮信號(hào)”促使表皮基底層細(xì)胞快速分裂，向下生長(zhǎng)并入侵真皮層，包裹真皮凝聚物形成了毛乳頭［11］。成熟毛囊進(jìn)入周期性再生循環(huán)時(shí)，Wnt／β－catenin信號(hào)通路主要與休止期靜息狀態(tài)維持，休止期向生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)換以及生長(zhǎng)期毛囊的快速重構(gòu)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt／β－catenin信號(hào)在休止期大部分時(shí)間內(nèi)被BMP信號(hào)所抑制，僅在休止期快結(jié)束時(shí)抑制效應(yīng)才被解除。Wnt／β－catenin信號(hào)在休止期被抑制主要是由于低水平的 Wnt／βcatenin信號(hào)能夠抑制隆突部?jī)?nèi)毛囊干細(xì)胞的增殖分化而維持毛囊休止期的靜息狀態(tài)。休止期末時(shí)，BMP信號(hào)水平降低，Wnt／β－catenin信號(hào)水平升高從而促使毛囊干細(xì)胞的增殖分化，繼而誘導(dǎo)毛囊由休止期向生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)換［12］。研究人員通過(guò)基因突變與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序相結(jié)合的技術(shù)手段也發(fā)現(xiàn)，β－catenin在生長(zhǎng)期起始時(shí)激活隆突部毛囊干細(xì)胞內(nèi)同細(xì)胞增殖分化相關(guān)基因的大規(guī)模表達(dá)［13］。也有研究發(fā)現(xiàn)，β－catenin基因功能缺失則導(dǎo)致毛囊滯留于休止期，不能正常地實(shí)現(xiàn)由休止期向生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)換［6］。生長(zhǎng)期時(shí)，大量的 Wnt／β－catenin信號(hào)通路基因以高水平且相互重疊的方式表達(dá)于毛囊內(nèi)部以維持毛囊生長(zhǎng)期的正常行進(jìn)［13］。有研究指出，生長(zhǎng)中期時(shí)β－catenin、Lef1等 Wnt／β－catenin信號(hào)通路上游基因高水平表達(dá)于毛母質(zhì)區(qū)域，促進(jìn)毛母質(zhì)內(nèi)毛干前體細(xì)胞向毛干各細(xì)胞譜系終末分化的過(guò)程而重構(gòu)毛干［14－15］。一些毛發(fā)特異性的角蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)域含有Lef／Tcf轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，因而受到 Wnt／βcatenin信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［16］。此外，一些具有促進(jìn)角蛋白細(xì)胞增殖分化作用的 Wnt／β－catenin信號(hào)通路靶基因如Shh、Jagged1等也在生長(zhǎng)期毛母質(zhì)內(nèi)高表達(dá)［17］。當(dāng)毛囊進(jìn)入由細(xì)胞凋亡驅(qū)使的退行期及休止期時(shí)，Wnt／β－catenin信號(hào)水平也逐漸減弱至基本消失［15］。

Wnt／β－catenin信號(hào)強(qiáng)弱與毛囊內(nèi)部細(xì)胞活動(dòng)及毛囊不同時(shí)期的轉(zhuǎn)換有直接關(guān)系。結(jié)合 Wnt／βcatenin信號(hào)通路上游基因在絨毛生長(zhǎng)不同時(shí)期絨山羊體側(cè)部皮膚組織中的表達(dá)規(guī)律推測(cè)，Wnt／βcatenin信號(hào)能夠通過(guò)對(duì)次級(jí)毛囊內(nèi)部細(xì)胞增殖分化的調(diào)控，而促進(jìn)次級(jí)毛囊由休止期向生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)換以及生長(zhǎng)期絨毛的快速生長(zhǎng)。但 Wnt／β－catenin信號(hào)通路各上游基因具體在毛囊內(nèi)的表達(dá)部位以及表達(dá)量與不同時(shí)期絨毛生長(zhǎng)速度的關(guān)系還需通過(guò)原位雜交及免疫組化等試驗(yàn)進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

哺乳動(dòng)物皮膚及毛發(fā)著色是一個(gè)受復(fù)雜基因互作網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的過(guò)程。Wnt／β－catenin作為哺乳動(dòng)物內(nèi)保守且具有重要生理作用的信號(hào)通路之一，也參與了皮膚及毛發(fā)的著色過(guò)程。Wnt／β－catenin信號(hào)通路拮抗基因Dkk1在人皮膚著色較淡的掌拓（手、腳）部位高表達(dá)而在著色較深的非掌拓部位低表達(dá)，表明Dkk1基因與人類不同部位的皮膚著色深淺相關(guān)［18］。β－catenin基因在不同毛色的羊駝皮膚組織中的表達(dá)量存在差異，表明β－catenin基因參與動(dòng)物毛發(fā)著色過(guò)程［19］。本試驗(yàn)對(duì) Wnt／β－catenin信號(hào)通路上游β－catenin、Lef1／Tcf3基因及該通路拮抗基因Dkk1mRNA在生長(zhǎng)旺盛期黑、白絨山羊皮膚組織中的相對(duì)表達(dá)量研究發(fā)現(xiàn)，上述基因在不同毛色絨山羊皮膚組織中的相對(duì)表達(dá)量并無(wú)顯著差異，表明Wnt／β－catenin信號(hào)通路可能并不參與絨毛的著色過(guò)程。該結(jié)果同前述研究并不相符。

黑色素細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生黑素為皮膚及毛發(fā)著色。Wnt／β－catenin信號(hào)通路參與皮膚及毛發(fā)著色過(guò)程主要與其調(diào)控黑色素細(xì)胞增殖分化的作用相關(guān)。低水平的Wnt／β－catenin信號(hào)維持黑素前體細(xì)胞－黑素干細(xì)胞的未分化狀態(tài)，高水平的 Wnt／β－catenin信號(hào)促進(jìn)黑素干細(xì)胞終末分化成為成熟的黑素細(xì)胞［20］。β－catenin在已分化的黑素細(xì)胞中低表達(dá)而在未分化完成的黑素細(xì)胞中高表達(dá)，說(shuō)明 Wnt／βcatenin信號(hào)主要是與黑素細(xì)胞生成及增殖分化相關(guān)，但可能并不參與已分化黑素細(xì)胞功能的調(diào)控［21］。之前研究中，Dkk1對(duì)不同部位皮膚著色深淺調(diào)節(jié)與其拮抗 Wnt／β－catenin信號(hào)而抑制黑素細(xì)胞增殖分化相關(guān)，也并沒(méi)有涉及已分化黑素細(xì)胞的功能調(diào)控［18］。黑素是由已經(jīng)分化的黑素細(xì)胞產(chǎn)生的，并被分泌到鄰近角蛋白細(xì)胞中而為皮膚及毛發(fā)著色。對(duì)于絨山羊來(lái)講，生長(zhǎng)旺盛期時(shí)絨毛生長(zhǎng)速度最快，此時(shí)次級(jí)毛囊內(nèi)已分化黑素細(xì)胞也大量產(chǎn)生黑素為絨毛著色。Wnt／β－catenin信號(hào)通路上游基因生長(zhǎng)旺盛期在黑、白絨山羊皮膚組織中的表達(dá)量并無(wú)差異，表明 Wnt／β－catenin信號(hào)通路并不涉及次級(jí)毛囊內(nèi)部已分化黑素細(xì)胞產(chǎn)生黑素而為絨毛著色的過(guò)程。本研究只初步探討 Wnt／β－catenin信號(hào)通路在是否參與生長(zhǎng)旺盛期絨毛著色過(guò)程，而Wnt／β－catenin信號(hào)通路在整個(gè)毛囊周期中絨毛著色過(guò)程中的作用還需對(duì) Wnt／β－catenin信號(hào)通路相關(guān)基因在不同時(shí)期及不同毛色絨山羊皮膚組織中的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。

4 結(jié) 論

Wnt／β－catenin信號(hào)通路上游β－catenin、Lef1／Tcf3基因mRNA在白色絨山羊不同時(shí)期體側(cè)部皮膚組織中的相對(duì)表達(dá)量具有明顯的變化規(guī)律即生長(zhǎng)前期緩慢上調(diào)，旺盛期表達(dá)量最高，生長(zhǎng)后期及退行期逐漸下調(diào)，休止期表達(dá)量最低；該通路拮抗基因Dkk1mRNA在白色絨山羊不同時(shí)期體側(cè)部皮膚組織中無(wú)明顯的變化規(guī)律。β－catenin、Lef1／Tcf3及Dkk1基因mRNA在生長(zhǎng)旺盛期黑、白絨山羊體側(cè)部皮膚組織中的表達(dá)并無(wú)顯著差異。Wnt／β－catenin信號(hào)通路參與絨毛周期性再生過(guò)程，但并不參與生長(zhǎng)旺盛期絨毛的著色過(guò)程。

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