王榮瓊　劉永張　鄒豐才　楊建發(fā)　彭潔.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，昆明650；.云南省昆明動(dòng)物園，昆明6500；.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明6500

孔雀嗉囊毛細(xì)線蟲的分子鑒定

王榮瓊1劉永張2鄒豐才3*楊建發(fā)3彭潔1
1.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，昆明650212；2.云南省昆明動(dòng)物園，昆明650021；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201

通過分子生物學(xué)方法對來自昆明市圓通山動(dòng)物園孔雀消化道中收集的線蟲進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，該線蟲與GenBank發(fā)表的澳大利亞袋鼠毛細(xì)線蟲COX1序列的相似性為77.3%，證明該線蟲為毛細(xì)科毛細(xì)屬的毛細(xì)線蟲。COX1序列分析表明序列差異較明顯，說明孔雀毛細(xì)線蟲不同于澳大利亞袋鼠毛細(xì)線蟲，它們存在著遺傳背景的差異。

孔雀；毛細(xì)線蟲；COX1序列；分子鑒定

毛細(xì)線蟲病是由毛細(xì)科（Capillariidae）毛細(xì)屬（Capillaria）的多種線蟲寄生于禽類食道、嗉囊、腸道等消化道內(nèi)的一種寄生蟲病。輕度感染時(shí)，局部出現(xiàn)輕微炎癥和增厚；嚴(yán)重感染時(shí)，炎癥加劇，并出現(xiàn)黏液或濃性分泌物，剖檢可見寄生部位消化道出血，黏膜上有大量蟲體，嚴(yán)重感染時(shí)，可引起死亡。病初如誤用消炎藥或抗球蟲藥，會延誤病情的治療，因此對其鑒定到種顯得由為重要[1]。

本項(xiàng)試驗(yàn)擬進(jìn)一步深入研究形態(tài)學(xué)所不能解決的問題，欲通過分子生物學(xué)技術(shù)鑒定孔雀嗉囊內(nèi)的毛細(xì)屬線蟲，以期能確定到種。這是首次在云南采用分子生物學(xué)的方法對孔雀寄生蟲的種屬關(guān)系進(jìn)行鑒定。對保護(hù)世界瀕危物種及鑒定寄生蟲的種類來豐富蟲種資源有重要的意義。也為今后孔雀體內(nèi)線蟲的分類、鑒別診斷、分子流行病學(xué)調(diào)查以及本病的防治等更深入的研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

蟲體樣品：由昆明市圓通山動(dòng)物園提供。

主要試劑：購買于北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1）蟲體的分離及處理。將園內(nèi)發(fā)病死亡的1只成年孔雀，用寄生蟲學(xué)完全解剖法獲取寄生于孔雀嗉囊內(nèi)的線蟲，將洗凈的蟲體轉(zhuǎn)移到新的離心管中用75%乙醇保存?zhèn)溆谩?/p>

用鑷子將保存在75%乙醇溶液中的蟲體材料取出，用雙蒸水反復(fù)吹打沖洗2～3次后，置于一新的1.5 mL的離心管中。

2）蟲體DNA的提取。蟲體DNA提取按細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒使用說明進(jìn)行。

3）蟲體DNA的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系中各試劑的量分別是ddH2O 10.75μL，10×PCR buffer 3.0 μL，MgCl2（25 mmol/L）4.0μL，dNTPs（2.5 mmol/L each）3.0μL，F(xiàn)orward primer（50 pmol/μL）0.5μL，Reverse primer（50 pmol/μL）0.5μL，rTap（5 U/μL）0.25μL，模板（gDNA）3.0μL，共計(jì)25μL?；靹蛉缓笥赑CR擴(kuò)增儀中按已設(shè)好PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，于紫外透射儀上觀察結(jié)果，并拍照記錄。

4）引物的設(shè)計(jì)。依據(jù)Bowles文獻(xiàn)[10]設(shè)計(jì)1對引物，擴(kuò)增了從孔雀嗉囊內(nèi)分離的線蟲線粒體DNA（mtDNA）細(xì)胞色素C氧化酶第1亞基（COX1），由上海生物工程技術(shù)有限公司產(chǎn)品合成。

JB3（5′-TTTTTTGGGGATCCTGAGGTTTAT-3′）

JB4.5（5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′）

2　結(jié)果與分析

2.1測序結(jié)果

電泳后，通過線性DNA條帶的相對位置可初步估計(jì)樣品的分子量大約為450 bp左右，如圖1所示。

圖1　擴(kuò)增的線蟲c o x 1 RCR產(chǎn)物

序列堿基數(shù)共計(jì)417個(gè)bp：

CCAATCATGATCTCGCATTTGGTGCAGTTTCT GAGCTTTGATAAATATTTCAGGAAAGTTTAAAGTA TTTGGCCCATTAGGAATAATCTATGCTATAATAAG AATCGGCTTATTAGGCTGTTTTGTTTGAGGTCATCA TATATATACTGTAGGAATAGACGTGGACACACGA GCATATTTTACTGCTGCTACTATGATCATTGGAGTC CCTACTGGAGTAAAAGTATTTAGCTGAATGGCTAC TATATACGGAACTTCCACTAAATCTTCACCTCTTTT ACTATGAACTTTAGGATTTATTTCATTATTTACAAT TGGAGGTCTAACCGGAATTTCTCTCTCTAATGCTT CTTTAGATCTTCTACTTCATGATACATACTACGTAG TAGGTCATTTTCATTATGTTCTTTCTTTAAA

測序結(jié)果與預(yù)期的一致，將上述測序結(jié)果上傳到網(wǎng)上進(jìn)行Blast分析，結(jié)果顯示該線蟲與澳大利亞袋鼠體內(nèi)的毛細(xì)線蟲有77.3%的同源性，因此確認(rèn)該線蟲為毛細(xì)線蟲。

2.2 COX1序列的分析與比較

測序后去掉引物，找到COX1序列的頭尾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)孔雀毛細(xì)線蟲樣品的COX1序列的長度為417 bp，而澳大利亞袋鼠毛細(xì)線蟲COX1序列（GenBank注冊號AJ288162.1）的長度為374 bp。

圖2　樣品與網(wǎng)上澳大利亞袋鼠的毛細(xì)線蟲COX1的相似百分比

圖3　COX 1對比的進(jìn)化樹

將該線蟲的COX1序列與網(wǎng)上公布的澳大利亞袋鼠毛細(xì)線蟲COX1序列用DNA Star軟件進(jìn)行比較相似百分比分析（圖2～3）可知，其COX1相似性為77.3%，序列差異較明顯（圖4）。發(fā)現(xiàn)孔雀毛細(xì)線蟲單獨(dú)形成一個(gè)分支，說明孔雀毛細(xì)線蟲不同于袋鼠毛細(xì)線蟲，他們存在著地域及遺傳背景的差異。也說明了孔雀毛細(xì)線蟲COX1序列存在種的特異性，可作為鑒別孔雀毛細(xì)線蟲與相似種的有效遺傳標(biāo)記。

圖4　孔雀毛細(xì)線蟲與澳大利亞袋鼠毛細(xì)線蟲CO X 1序列比較

3　結(jié)論

野生動(dòng)物寄生蟲研究較少，很多寄生蟲嚴(yán)重威脅著我國珍貴野生動(dòng)物。將該線蟲的COX1序列與GenBank公布的澳大利亞袋鼠的毛細(xì)線蟲的COX1比較分析，相似性為77.3%。說明孔雀毛細(xì)線蟲與袋鼠毛細(xì)線蟲具有遺傳背景差異，也說明孔雀毛細(xì)線蟲COX1序列存在種的特異性，可作為鑒別孔雀毛細(xì)線蟲與相似種的有效遺傳標(biāo)記。但對野生動(dòng)物寄生蟲的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)還不夠，需要投入更多的人力和物力來填補(bǔ)這方面的空白[2-6，8]。

近年來線粒體DNA已被廣泛用作多態(tài)性研究的重要遺傳標(biāo)記，結(jié)合PCR擴(kuò)增及其他方法已成功地應(yīng)用于多種寄生蟲的分子鑒定和分類，通過其序列的變化可反映生物種群內(nèi)和群體間的遺傳變異，且mtDNA特別適用于相似種和亞種的鑒定[7-8]。

[1]謝輝，馮志新.香港地區(qū)螺旋線蟲種類記述[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，15（1）：30-34.

[2]王伯瑤，黃寧主編.分子生物學(xué)技術(shù)[M].北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2006：37-45.

[3]王洪英.藍(lán)孔雀常見疾病的癥狀及防治措施[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2009（4）：55-56.

[4]陳虹虹，陳曉梅，朱興全，等.PCR-SSCP對我國魯?shù)婪驅(qū)γつ揖€蟲的分子鑒定[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，26（1）：35-38.

[5]索勛，楊曉野.高級寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2005：221-228.

[6]牛慶麗，羅建勛，殷宏.轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）在寄生蟲分子生物學(xué)分類中的應(yīng)用及其進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)寄生蟲病，2008，16（4）：41-44.

[7]張路平，孔繁瑤.線粒體DNA在線蟲學(xué)研究中的應(yīng)用[J].寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報(bào)，1997，4（3）：178，182.

[8]趙光輝，張改平，寧長申，等.基于COX1基因?qū)ωi囊尾蚴河南分離株種系發(fā)育關(guān)系的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39（1）：72-78.

2015-07-04

云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目（2010C130）

王榮瓊，女，1978年生，在職獸醫(yī)碩士，副教授。