馬晨 向志雄 萬(wàn)惠新 劉基曄 夏廣新（上海醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司中央研究院 上海 201203）

小分子抗腫瘤藥物SPH0396在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)

馬晨 向志雄 萬(wàn)惠新 劉基曄 夏廣新
（上海醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司中央研究院 上海 201203）

目的：建立定量測(cè)定大鼠血漿中抗腫瘤藥aSPH0396的LC-MS/MS方法，并將其應(yīng)用于大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究。方法：血漿樣品在Waters BEH C18柱上以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液進(jìn)行梯度洗脫；采用MRM方式進(jìn)行定量測(cè)定，監(jiān)測(cè)離子對(duì)為m/z 553.4→453.4（SPH0396）和m/z 533.3→259.9（內(nèi)標(biāo)ponatinib）。結(jié)果：SPH0396在1.11～2 488.50 ng/ml的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（R2=0.999），定量下限為1.11 ng/ml，回收率和精密度均符合生物樣品檢測(cè)要求。大鼠靜注3 mg/kg SPH0396后，t1/2為3.43±0.37 h，CL為2.13±0.21L/h·kg，Vdss為6.76±0.26 L/kg。大鼠口服5、15 和50 mg/kg的SPH0396后吸收較慢，Tmax為4～6 h。大鼠口服不同劑量的SPH0396，Cmax和AUC(0-t)的增加比例均高于劑量增加比例，生物利用度分別為17.15%、25.58%和36.19%。結(jié)論：本研究首次建立了特異、靈敏、便捷的定量檢測(cè)大鼠血漿中SPH0396的LC-MS/MS方法，并成功應(yīng)用于SPH0396的大鼠藥代動(dòng)力學(xué)研究。

酪氨酸激酶抑制劑 藥代動(dòng)力學(xué) LC-MS/MS

酪氨酸激酶（TKs）在許多生理過(guò)程都發(fā)揮關(guān)鍵性作用，而它的活性失調(diào)被證明與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。近年來(lái)，以酪氨酸激酶為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物研發(fā)已成為國(guó)際上抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)，多種小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）被批準(zhǔn)上市用于腫瘤治療[1-3]。本研究院針對(duì)Bcr-Abl靶點(diǎn)[4-7]，設(shè)計(jì)并合成了一系列化合物，并對(duì)其中部分化合物進(jìn)行了體外藥效學(xué)和早期代謝性質(zhì)的評(píng)價(jià)。其中SPH0396（圖1）在激酶和細(xì)胞水平的抗腫瘤活性均接近或優(yōu)于上市藥物bosutinib[8-11]（圖1），體內(nèi)外藥代性質(zhì)良好。因此將其選為候選化合物進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，用于對(duì)伊馬替尼耐藥的慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）。本文對(duì)SPH0396在雄性大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

SPH0396由上海醫(yī)藥中央研究院提供，純度99.69%；內(nèi)標(biāo)帕納替尼(ponatinib，圖1；Molttl公司）；色譜純級(jí)乙腈（德國(guó)Merck公司）；色譜純級(jí)甲酸（德國(guó)CNW公司）；其它分析純級(jí)試劑均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司；實(shí)驗(yàn)用純水由Milli-Q純水儀制備而成。

圖1 SPH0396, bosutinib 和ponatinib的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.2 儀器

Acquity UPLC液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）串聯(lián)API4000 Q-trap型三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)器（美國(guó)Applied Biosystems公司），配有ESI源、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；CPA225D分析天平（德國(guó)Satroious公司）；Mulrifuge X3R高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；V230多管振蕩器（美國(guó)Fisher公司）；Milli-QTM型超純水凈化器（美國(guó)Millipore公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，雄性，180～220 g，由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。許可證號(hào)SCXK（滬）2013~0016。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 LC/MS檢測(cè)條件

色譜條件：色譜柱為BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 mm，美國(guó) Waters公司）。流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈溶液，洗脫程序如下：0～0.5 min 流動(dòng)相A和B的比例為95∶5，0.5～1.0 min線性變至5∶95，1.0～2.2 min維持5∶95，2.2～2.5 min線性恢復(fù)至95∶5，2.5～3 min保持95∶5。流速0.3 ml/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量5 ml。

質(zhì)譜條件：離子源為ESI源，正離子模式檢測(cè)；毛細(xì)管電壓5 500 V，離子源溫度500 ℃，干燥氣10 L/ min，霧化氣50 psi，碰撞氣壓力（CAD）為Medium；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），用于定量分析的離子對(duì)分別為SPH0396，m/z 553.4→453.4，去簇電壓（DP）80 V，碰撞能量（CE）30 V；內(nèi)標(biāo)ponatinib，m/z 533.3→259.9，DP143 V，CE 30 V。

2.2 樣品處理方法

大鼠血漿樣品50 ml，加入200 ml含內(nèi)標(biāo)（ponatinib，0.25 mmol/L）的乙腈沉淀蛋白，渦旋振蕩10 min后，于6 000 g離心10 min，取200 ml上清于6 000 g再次離心10 min，取上清50 ml于96孔板中進(jìn)樣，進(jìn)樣量5 ml。

2.3 LC/MS方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

精密稱取SPH0396粉末5.03 mg，加入90.9 ml的DMSO，配制為100 mmol/L的儲(chǔ)備液。再將此儲(chǔ)備液用乙腈逐級(jí)稀釋成濃度為22.14、55.35、166.04、553.46、1 600.38、5 534.60、16 603.80、33 207.60、49 811.40 ng/ ml的系列工作液。取95 ml的空白大鼠血漿加入5 ml的上述工作液，配制成濃度為1.11、2.77、8.30、27.67、83.02、276.73、830.19、1 600.38、2 490.57 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線。取50 ml的含藥血漿按2.2項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)液的配制

精密稱取ponatinib 2.53 mg，加入47.5 ml的DMSO，配制為100 mmol/L的儲(chǔ)備液。取上述儲(chǔ)備液2.5 ml，加入1 L乙腈，配制為0.25 mmol/L的內(nèi)標(biāo)液。

2.3.3 質(zhì)控樣品的配制

將2.3.1中100 mmol/L的SPH0396儲(chǔ)備液用乙腈逐級(jí)稀釋成濃度為49.81、11 069.20和38 742.20 ng/ml的系列質(zhì)控工作液。取95 ml的空白大鼠血漿加入5 ml的質(zhì)控工作液，配制成濃度為2.49、553.46、1 937.11 ng/ ml的質(zhì)控樣品。取50 ml的含藥血漿按2.2項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣。

2.4 大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

SD大鼠16只，雄性，180～220 g。分為4組，每組4只。分別靜脈注射3 mg/kg或灌胃給予5、15和50 mg/kg的SPH0396，于給藥前和給藥后2、5、15、30、60、90、120、240、360、480、600、1 440 min分別于大鼠眼底靜脈叢取血0.2 ml。血樣于8 000 r/min離心5 min，取血漿于離心管中-20 ℃保存待測(cè)。

2.5 數(shù)據(jù)處理方法

SPH0396的血藥濃度-時(shí)間曲線用Kinetica軟件(Version 5.1，美國(guó))的非房室模型進(jìn)行擬合，得到藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。Cmax為實(shí)測(cè)的最大血藥濃度，Tmax為口服給藥后血藥濃度達(dá)峰時(shí)間，t1/2為末端消除半衰期，MRT為體內(nèi)平均滯留時(shí)間，血藥濃度-時(shí)間曲線下面積AUC(0-t)由梯形面積法計(jì)算得到，Vdss為穩(wěn)態(tài)時(shí)表觀分布容積，CL為清除率。絕對(duì)生物利用度計(jì)算公式如下：

注：i.v為靜脈注射；p.o為口服

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 方法的專屬性

用來(lái)自6只大鼠的空白血漿配制標(biāo)準(zhǔn)樣品，空白血樣、空白血樣加標(biāo)準(zhǔn)品和大鼠給藥后4 h血樣的MRM色譜圖見(jiàn)圖2。大鼠血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾SPH0396和內(nèi)標(biāo)ponatinib的測(cè)定，SPH0396的保留時(shí)間為1.59 min，ponatinib的保留時(shí)間為1.95 min，表明方法專屬性良好。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

按2.3.1項(xiàng)下方法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品并進(jìn)行測(cè)定，以SPH0396樣品峰面積比ponatinib內(nèi)標(biāo)峰面積（As/Ai）對(duì)濃度（C）作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.265 7x+0.007 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999。線性范圍為1.11～2 490.57 ng/ml，定量下限為1.11 ng/ml。

圖2 大鼠血漿中的SPH0396的MRM色譜圖

3.3 精密度和準(zhǔn)確度

配制低、中、高3個(gè)濃度（2.49、553.46、1 937.11 ng/ml）的SPH0396質(zhì)控樣品各6份，用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)控樣品測(cè)得濃度。以質(zhì)控樣品測(cè)得濃度與加樣濃度相比計(jì)算方法的準(zhǔn)確度與精密度（表1）。RSD均小于10%。

表1 LC-MS/MS測(cè)定方法的精密度與準(zhǔn)確度

3.4 大鼠靜脈注射SPH0396后的藥代動(dòng)力學(xué)

大鼠單次靜脈注射3 mg/kg的SPH0396后采集血樣，按2.2項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，測(cè)定SPH0396在大鼠血漿中的濃度，采用Kinetica計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（表2）。大鼠靜脈注射SPH0396后，AUC(0-t)為1 391.08±132.92 h·ng/ml，消除半衰期為3.43±0.37 h，清除率為2.13±0.21 L/h·kg，表觀分布容積為6.76±0.26 L/kg。

表2 大鼠靜脈注射或口服SPH0396后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（±s，n=4）

表2 大鼠靜脈注射或口服SPH0396后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（±s，n=4）

給藥方式(mg/kg) AUC(0-t) (h·ng/ml) AUC(0-∞) (h·ng/ml) MRT(0-t) (h)t1/2(h)Cmax(ng/ml)Tmax(h)CL (L/h·kg)Vdss (L/kg)F (%)靜脈注射31 391.08±132.921 400.50±139.083.19±0.193.43±0.37688.49±43.010.03±0.002.13±0.216.76±0.26灌胃5397.65±15.15403.71±13.936.88±0.223.67±0.4345.68±10.974.67±1.15\17.15 151 779.44±358.001 787.46±359.136.79±0.122.79±0.08156.36±15.015.33±1.15\25.58 508 389.82±1 805.818 838.23±2 056.177.46±0.564.10±0.54668.42±104.746.00±2.00\36.19

3.5 大鼠灌胃給予SPH0396后的藥代動(dòng)力學(xué)

大鼠單次口服5、15和50 mg/kg的SPH0396后的血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖3?？诜PH0396在大鼠體內(nèi)吸收較慢，血藥濃度在4～6 h才能達(dá)到峰值；Cmax分別為45.68±10.97、156.36±15.01和668.42±104.72 ng/ ml；AUC(0-t)分別為397.65±15.15、1 779.44±358.00和8 389.82±1 805.81 h·ng/ml。大鼠口服不同劑量的SPH0396，Cmax和AUC(0-t)的增加比例均高于劑量增加比例。相應(yīng)的大鼠口服不同劑量的SPH0396生物利用度分別為17.15%、25.58%和36.19%。

圖3 大鼠靜脈注射或口服SPH0396后的血藥濃度-時(shí)間曲線（±s，n=4）

4 討論

SPH0396是一個(gè)新結(jié)構(gòu)的抗CML候選化合物。靜脈給藥后，SPH0396在大鼠體內(nèi)的消除半衰期較長(zhǎng)，表觀分布容積大于大鼠總體液量，說(shuō)明SPH0396在大鼠體內(nèi)分布較廣。大鼠口服不同劑量的SPH0396，Cmax和AUC(0-t)的增加比例均高于劑量增加比例，表明SPH0396在大鼠體內(nèi)的吸收是非線性的，提示可能有外排轉(zhuǎn)運(yùn)體參與SPH0396的吸收過(guò)程，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。SPH0396為bosutinib的結(jié)構(gòu)類似物，我們的研究表明，其在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)接近或優(yōu)于bosutinib，在激酶和細(xì)胞水平的抗腫瘤活性也均接近或優(yōu)于bosutinib[9-11]，可做為候選化合物進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

本研究建立并驗(yàn)證了定量測(cè)定大鼠血漿中SPH0396的LC-MS/MS方法。該方法的專屬性好，靈敏度高，回收率和精密度均符合生物樣品的定量分析要求，可用于該化合物在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

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Pharmacokinetics study of an anti-tumor candidate SPH0396 in rats

MA Chen, XIANG Zhixiong, WAN Huixin, LIU Jiye, XIA Guangxin
(Central Research Institute, Shanghai Pharmaceuticals Holding Co. Ltd., Shanghai 201203, China)

Objective: To develop and validate an LC-MS/MS method for the quantitative analysis of a new antitumor candidate SPH0396 in rat plasma so as to be applied to the pharmacokinetic study in rats. Methods: The chromatographic separation of SPH0396 was performed on BEH C18column by a gradient elution with water containing 0.1% formic acid and acetonitrile containing 0.1% formic acid. The MS detection was conducted on MRM mode and the ion-pairs monitored were m/z 553.4→453.4 (SPH0396) and m/z 533.3→259.9 with ponatinib as an internal standard. Results: A standard curve for the determination of SPH0396 showed a good linearity over the range of 1.11～2 488.50 ng/ml (R2=0.999) with the lower limit of quantification at 1.11 ng/ml. The recovery and precision could meet the requirement of bioanalysis. After intravenous administration of SPH0396, the t1/2, CL and Vdss in rats were 3.43±0.37 h, 2.13±0.21 L/h·kg and 6.76±0.26 L/kg, respectively. The absorption of SPH0396 in rats was slow after oral administration. The peak level was reached at 4～6 h. The oral bioavailability was 17.15%, 25.58% and 36.19% at different doses, respectively. Conclusion: The LC-MS/MS method is specific, sensitive, rapid and simple and is suitable for pharmacokinetic study of SPH0396 in rats．

tyrosine kinase inhibitors; pharmacokinetics; LC-MS/MS

R969.1

A

1006-1533(2015)11-0070-05

2015-01-16)