張?zhí)K閩　湯曉樞　周媛媛（上海長城藥業(yè)有限公司　上?！?01707）

腦蛋白水解物原料肽含量測定方法的改進

張?zhí)K閩湯曉樞*周媛媛
（上海長城藥業(yè)有限公司上海201707）

目的：優(yōu)化腦蛋白水解物原料肽含量測定方法。方法：采用Agilent Zorbax Eclipse-AAA色譜柱（4.6 mm×150 mm, 5 mm）, 流動相A：0.04 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.80）, 流動相B：乙腈-甲醇-水（45∶45∶10）, 流速1.5 ml/min, 柱溫40 ℃, 檢測波長：338 nm, 262 nm, 梯度洗脫。結果：各種氨基酸的濃度在15.0～120.0 mg/ml范圍內與峰面積呈良好的線性關系（r＞0.999）, 各種氨基酸的平均回收率為98.1%～103.6%。結論：該方法快速、簡便、專屬性強、重復性好, 結果準確可靠, 適用于腦蛋白水解物原料肽含量的測定。

腦蛋白水解物原料肽含量測定氨基酸高效液相色譜

腦蛋白水解物原料（國藥準H31023028）為我們公司原料藥車間生產的原料藥，系健康豬的鮮大腦經脫脂和水解而成。2013年6月28日國家藥典委員會發(fā)布了《關于腦蛋白水解物原料國家標準的公示稿》，明確了需進行腦蛋白水解物原料肽含量的測定，即需對腦蛋白水解物原料中游離及水解氨基酸含量進行測定，并用于計算肽含量（肽含量=水解氨基酸含量-游離氨基酸含量）。

大多數氨基酸不含有芳香環(huán)等生色團，無紫外吸收，需要先將氨基酸衍生為具有較強紫外或熒光吸收的衍生物[1]。氨基酸HPLC柱前衍生化的分析方法有多種，以Waters AccQ·Tag衍生法[2-4]、OPA-FMOC（鄰苯二甲醛—9-芴甲基氯甲酸酯）衍生法測定氨基酸最為常用[5-7]。本公司曾用OPA-FMOC衍生法測定腦蛋白水解物原料中游離及水解氨基酸含量（色譜柱Hypersil ODS-C18：4.6 mm×100 mm，5 mm，流動相A：pH 7.20的醋酸鹽緩沖液，流動相B：pH 7.20的醋酸鹽緩沖液-乙腈-甲醇，梯度洗脫）。但我們發(fā)現(xiàn)該種色譜條件在分析檢測氨基酸時存在以下問題：①在同時分離16種氨基酸時，部分氨基酸分離度差，系統(tǒng)適用性不佳；。②測定方法的重現(xiàn)性差；③進行梯度洗脫的A、B相鹽濃度高，直接影響色譜柱的使用壽命；④該系統(tǒng)對pH較敏感，配制A、B相pH誤差會直接影響氨基酸的分離。本研究參考文獻優(yōu)化了腦蛋白水解物原料肽含量測定的方法[8]。

1　儀器與試藥

Agilent 1100液相色譜儀，DAD檢測器、自動進樣器（安捷倫科技中國有限公司）。Sartorius BP121S電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）。16種氨基酸對照品（批號：140624-200805，中國藥品生物制品檢定所）。腦蛋白水解物原料（批號：20101102）為本公司產品。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，磷酸氫二鈉及其他試劑均為分析純。

2　方法與結果

2.1色譜條件

Agilent Zorbax Eclipse-AAA色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 mm），流動相為A：0.04 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）(取磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）6.24 g，加水1 000 ml溶解，用5 mol/L的氫氧化鈉溶液將pH調至7.80±0.05)；流動相B：乙腈-甲醇-水（45∶45∶10），按表1進行梯度洗脫。柱溫：40 ℃。檢測波長：338 nm，262 nm。流速：1.5 ml/min.。

表1 梯度洗脫

2.216種氨基酸對照品溶液的配制

對照品溶液的制備：稱取16種氨基酸對照品各約30 mg，至100 ml容量瓶中，以0.04 mol/L鹽酸溶液溶解至刻度（對照品貯備液），再精密量取2 ml，至10 ml容量瓶中用水稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.3供試品溶液的配制

游離氨基酸含量測定供試品溶液：精密稱重腦蛋白水解物原料300 mg，置100 ml容量瓶中，加水溶解并超聲10 min，加水稀釋至刻度，濾過，取續(xù)濾液作為游離氨基酸含量測定供試品溶液。

水解氨基酸含量測定供試品溶液：精密稱取腦蛋白水解物原料200 mg，置硬質安瓿中，加鹽酸2 ml，搖勻，充氮封口，于110 ℃水解20 h，放冷，啟封后溶液置蒸發(fā)皿中，水浴蒸發(fā)至干，加水使殘留物溶解并稀釋至100 ml，作為水解氨基酸含量測定供試品溶液。

2.4衍生化程序

采用Agilent液相色譜儀自帶的柱前衍生的方法，設定進樣程序，對所得的氨基酸樣品進行衍生化反應，進樣器程序設定見表2。

表2　衍生進樣程序設定

氨基酸衍生試劑配制方法：

小瓶 1：8 mg/ml鄰苯二甲醛（OPA）溶液：精密稱取80 mg鄰苯二甲醛（OPA），依次加入7 ml硼酸緩沖液溶液、1 ml乙腈和125 ml 巰基丙酸，搖勻并溶解，即得。

小瓶 2：5 mg/ml 9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC）溶液：精密稱取50 mg 9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC），用乙腈溶解并稀釋至10 ml，搖勻并溶解，即得。

小瓶 3：雙重蒸餾水。

小瓶 4：硼酸緩沖液：精密稱取1.236 g硼酸至50 ml容量瓶中，加水超聲至全部溶解，用40%氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至10.2，即得。

2.5方法學考察

2.5.1系統(tǒng)適用性試驗

取需測定的16種氨基酸的對照品：門冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、組氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、蘇氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、色氨酸(Trp)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、鹽酸賴氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)，依法配制對照品溶液，衍生后進樣，進行系統(tǒng)適用性試驗（圖1）。

圖1 色譜條件改進前后16種氨基酸系統(tǒng)適用性試驗色譜圖

從圖1A可見，在該色譜條件下，需測定的16種氨基酸均能完全分離，峰形佳，較圖1B中原色譜分離條件有了明顯的改善。分離度數據顯示（表3），改進前16種氨基酸的分離度未完全達到藥典規(guī)定的分離度要求，纈氨酸與甲硫氨酸、亮氨酸與賴氨酸的分離度僅大于1.0，且甘氨酸與蘇氨酸未完全分離。經色譜條件改進優(yōu)化后各氨基酸的分離度均大于1.5，分離效果明顯改善，實現(xiàn)了16種氨基酸在同一色譜條件下的完全基線分離。

表3　16種氨基酸峰分離度

2.5.2線性范圍

分別取16種氨基酸對照品配制成一系列濃度的混合對照品溶液，分別取上述對照品溶液衍生后進樣，并計算16種氨基酸的線性回歸方程（表4）。

表4　16種氨基酸線性試驗

結果顯示，16種氨基酸的濃度在約15.0～120.0 mg/ml范圍內與峰面積呈良好的線性關系（r＞0.999）。

2.5.3精密度試驗

分別取16種氨基酸對照品溶液衍生后連續(xù)進樣6次，結果見表5。

連續(xù)進樣6次16種氨基酸峰面積偏差的RSD均＜2.0%?？芍撋V條件下氨基酸測定方法的精密度較好。

2.5.4重復性試驗

取同一批供試品，依法制備游離氨基酸和水解氨基酸供試品溶液各6份，衍生后分別測定游離、水解氨基酸的含量，并分別計算腦蛋白水解物原料肽含量（表6）。

由表6結果可知：肽含量均值為419.5 mg/g，RSD小于2.0%，表明采用該方法測定腦蛋白水解物原料肽含量重復性較好，測定結果可靠。

2.5.5溶液穩(wěn)定性試驗

取制備的游離氨基酸和水解氨基酸供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18、24 h衍生并進樣檢測，以0 h進樣樣品的含量為100%，比較供試品溶液中各氨基酸的日內穩(wěn)定性(表7)。

表5　腦蛋白水解物原料肽含量測定精密度試驗

表6　腦蛋白水解物原料肽含量測定重復性試驗（mg/g）

表7　腦蛋白水解物原料供試品溶液穩(wěn)定性試驗(%)

結果顯示，游離和水解供試品溶液中所含16種氨基酸在24 h內的含量變化的RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定，含量測定結果可靠。

2.5.6加樣回收試驗

取供試品適量，按照高（120%）、中（100%）、低（80%）三個濃度加入含16種氨基酸的對照品儲備液，依法制備加樣回收的供試品溶液，每個濃度各3份。取上述加樣溶液衍生后進樣，并計算加樣回收率(表8)。

結果表明，游離、水解氨基酸含量測定中16種氨基酸的回收率均在98.1%～103.6%范圍內，RSD均小于2.0%，證明本方法回收率結果良好。

2.6樣品測定

取不同批次的腦蛋白水解物原料，依法制備游離、水解供試品溶液，并衍生化進樣。測定并計算肽含量（表9）。

表8　腦蛋白水解物原料肽含量測定加樣回收試驗(%)

表9　腦蛋白水解物肽含量測定（mg/g）

3　討論

3.1檢測器的選擇

OPA-FMOC衍生法測定氨基酸，其中一級氨基酸（Asp、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Ala、Val、Met、Trp、Ile、Phe、Leu、Lys共15種）首先與OPA反應，形成OPA-氨基酸，在338 nm下有最大吸收。二級氨基酸（Pro）則與FMOC衍生生成FMOC-氨基酸，在262 nm下有最大吸收。因加入吲哚與3-巰基丙酸相結合降低了氨基酸的疏水性，所以OPA衍生化產物較FMOC衍生化產物色譜出峰時間較早。

在原有方法中，我們選用VWD檢測器進行檢測，并在一級氨基酸中最后出峰的鹽酸賴氨酸(Lys)出峰后設置一個波長切換，檢測波長由338 nm切換至262 nm，用于檢測二級氨基酸的脯氨酸(Pro)。該方法對使用的紫外檢測器要求不高，但因波長切換導致檢測器的急速光柵變化，脯氨酸(Pro)出峰時檢測器未必達到穩(wěn)定的狀態(tài)，且在波長切換時如基線發(fā)生抖動，會在圖譜上形成一個較大的上升、下降平臺，使得262 nm下脯氨酸檢測數據不穩(wěn)定。故我們建議采用DAD檢測器進行兩級氨基酸的檢測，即分別連續(xù)收集338 nm和262 nm兩個波長的信號，這樣保證了一級、二級氨基酸同時檢測的準確性。

3.2參比波長的設定

在Agilent Zorbax Eclipse-AAA色譜柱說明書中，明確規(guī)定了氨基酸檢測參比波長的設定，參比波長的設定參數如下：338 nm：10 nm帶寬（bw），參比波長：390 nm，20 nm帶寬（bw）（適用于OPA-氨基酸）；262 nm：16 nm帶寬（bw），參比波長：324 nm，8 nm帶寬（bw）（適用于FMOC-氨基酸）。峰寬：＞0.03 min（0.5 s）。狹縫間距：4 nm。

在方法優(yōu)化過程中我們進行了相關比對試驗，對比了其與工作站默認參比波長設置的區(qū)別，結果顯示采用這種參比波長的設定，對于氨基酸檢測的圖譜起到了明顯的優(yōu)化作用，設定后梯度洗脫條件下色譜圖的基線較未設定前更平穩(wěn)，不再有明顯漂移。各氨基酸峰的對稱性也有改善，峰型更佳。從而提高了多種氨基酸含量測定的準確性（圖2）。

圖2　參比波長優(yōu)化前后16種氨基酸的分析圖譜

3.3流動相的改進

原方法中使用的流動相存在以下問題：①流動相A為pH 7.20的醋酸鹽緩沖液，流動相B為pH 7.20的醋酸鹽緩沖液-乙腈-甲醇，兩相均為較高濃度的鹽溶液，對色譜柱、液相泵的使用壽命影響較大；②流動相B為鹽溶液與有機溶劑的混合溶液，該混合溶液為不穩(wěn)定體系，在分析過程中可能會有鹽析出，影響氨基酸的分離；③該系統(tǒng)對流動相pH非常敏感，要求我們配制A、B相的pH誤差范圍應為7.20±0.05，如有誤差則會影響各氨基酸的分離度。

改進后的色譜條件A相為一定濃度的磷酸鹽溶液，B相則為不含鹽的乙腈、甲醇、水的混合液，降低了對色譜柱、液相泵的損耗。且該系統(tǒng)對流動相的pH敏感性較低，pH的誤差對氨基酸分離的影響不大，也大大提高了流動相配制的便捷性。

3.4鹽酸對于色譜柱的損耗

色氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和脯氨酸為疏水氨基酸，均難溶于水，在原有操作規(guī)程中我們采用0.04 mol/L鹽酸溶液作為溶劑配制對照品溶液。在大量的試驗過程中，我們發(fā)現(xiàn)鹽酸對于色譜柱存在損耗，使得色譜柱柱效下降，壽命縮短。故我們改進了對照品溶液的配制方式。先將以上氨基酸配制為高濃度的對照品貯備液（配制濃度為測試濃度的5倍，溶劑為0.04 mol/L鹽酸溶液），使其完全溶解，再使用雙蒸水稀釋至合適濃度，這種配制方式大大降低了對照品溶液中鹽酸的濃度，更好的保護了色譜柱。

在水解氨基酸樣品前處理時，我們需將腦蛋白水解物原料用濃鹽酸水解后制備供試樣品溶液。在處理過程中我們將酸水解后的樣品水浴蒸干，再使用雙蒸水溶解并稀釋。這一過程的目的同樣是將供試品中的鹽酸盡可能去除，起到保護色譜柱的作用。

4　結論

經方法學驗證，本研究所建立的肽含量測定方法操作簡便、專屬性強，能準確測定腦蛋白水解物原料中肽的含量。

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Optimization of a method for the determination of peptide content in cerebroprotein hydrolysate

ZHANG Sumin, TANG Xiaoshu*, ZHOU Yuanyuan
(Shanghai Greatwall Pharmaceutical CO. LTD., Shanghai 201206, China)

Objective: To optimize a method for the determination of peptide content in cerebroprotein hydrolysate. Methods: HPLC was performed on an Agilent Zorbax Eclipse-AAA column（4.6 mm×150 mm, 5 mm）with mobile phase A: 0.04 mol/L phosphate buffer (pH 7.8) and mobile phase B: acetonitrile-methanol-water (45：45：10) at UV detection wavelength of 338 nm and 262 nm, flow rate of 1.5 ml/min (gradient elution) and column temperature of 40 ℃. Results: The standard curve of every amino acid was linear over the range of 15.0~120.0 mg/ml (r＞0.999）with average recovery 98.1%~103.6%. Conclusion: This method is simple, accurate, sensitive and reproducible, and can be applied in the determination of peptide content in cerebroprotein hydrolysate.

cerebroprotein hydrolysate; determination of peptide content; amino acids; HPLC

R927.2; O657.72

A

1006-1533(2015)13-0074-06

湯曉樞(1979-), 男, 工程師, 從事化學與生化藥品研發(fā)工作。E-mail: tangxiaoshu_1979@126. com

2015-03-03)