鄔志杰 吳更 唐鴻志 許平

尼古丁是一類廣泛存在于土豆、番茄和煙草等茄科植物中的天然生物堿［1］，尼古丁對(duì)哺乳動(dòng)物能產(chǎn)生多種致病、致變、致癌效應(yīng)，且易溶于水，會(huì)污染土壤及水環(huán)境［2-4］。利用微生物來代謝尼古丁，是治理尼古丁污染的一種有效方法。

惡臭假單胞菌S16是一株尼古丁高效降解菌［5］，其利用吡咯途徑代謝尼古?。?］：尼古丁經(jīng)由N-甲基麥斯明、假氧化尼古丁、3-琥珀酰吡啶、6-羥基-3-琥珀酰吡啶（6-Hydroxy-3-succinoyl-pyridine，HSP）、2，5-二羥基吡啶（2，5-Dihydroxy-pyridine，DHP）、N-甲酰馬來酰胺酸、馬來酰胺酸、馬來酸及富馬酸，最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)［7，8］。

2011年，單加氧酶HspB及其編碼基因hspB被發(fā)現(xiàn)，其負(fù)責(zé)催化HSP轉(zhuǎn)化成DHP［9］。HspB以FAD（黃素腺嘌呤二核苷酸、氧化態(tài)）為輔基，以NADH（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，還原態(tài)）為輔酶，其催化底物發(fā)生羥化機(jī)制也已經(jīng)明確［10］。HspB在整個(gè)尼古丁代謝途徑中十分關(guān)鍵，將hspB基因缺失后，P. putida S16無法進(jìn)行尼古丁代謝。因此，獲得HspB的結(jié)構(gòu)對(duì)于研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系十分有利。

通過基因工程構(gòu)建重組質(zhì)粒，在大腸桿菌中表達(dá)外源蛋白，獲得高純度的蛋白得到單晶，并用于X射線衍射，這是晶體衍射學(xué)常用的方法［11］。而前期研究也表明，可以通過大腸桿菌表達(dá)純化得到可溶性的帶有His標(biāo)簽的HspB蛋白。然而其晶體的培養(yǎng)卻十分困難［12］。雖然His標(biāo)簽對(duì)于蛋白結(jié)構(gòu)影響較?。?3］，但也有文獻(xiàn)報(bào)道切除His標(biāo)簽可能會(huì)有利于晶體的培養(yǎng)，值得嘗試［14，15］，同時(shí)亦有許多蛋白結(jié)構(gòu)是通過切除His標(biāo)簽的蛋白獲得的［16-18］。

本研究在前期構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒的基礎(chǔ)上［12］，通過突變PCR定點(diǎn)引入TEV蛋白酶酶切序列，從而實(shí)現(xiàn)了其重組蛋白產(chǎn)物能夠被TEV蛋白酶切割，達(dá)到去除His標(biāo)簽的目的，并利用該蛋白進(jìn)行結(jié)晶研究。旨為后續(xù)獲得該蛋白結(jié)構(gòu)，闡釋其功能和結(jié)構(gòu)間的聯(lián)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌種 表達(dá)質(zhì)粒pET28a-hspB（抽提自大腸桿菌DH5α），大腸桿菌DH5α 和大腸桿菌BL21（DE3）均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 FastPfu聚合酶購自全式金公司，Dpn I購自NEB公司，TEV蛋白酶（帶有N端6×His標(biāo)簽）為本實(shí)驗(yàn)自制，酶質(zhì)粒小抽試劑盒購自Qiagen公司，實(shí)驗(yàn)所用結(jié)晶試劑盒購自Hampton Research、EMBio、Jena Bioscience、Molecular Dimension等。其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 PCR儀（EDC 810）購自東勝公司，細(xì)胞破碎儀購自廣州聚能，Ni2+-NTA填充柱料購自Qiagen公司，水平與垂直電泳儀和凝膠成像儀均購自上海天能，?KTA prime Plus 購自GE，紫外分光光度計(jì)（UV-1800）購自上海美譜達(dá)。

1.2 方法

圖2 重組質(zhì)粒pET28a-hspB-TEV-His構(gòu)建示意圖

1.2.1 引物設(shè)計(jì)、突變PCR及產(chǎn)物鑒定 為實(shí)現(xiàn)在重組HspB蛋白C端和6×His標(biāo)簽之間加入TEV蛋白酶酶切識(shí)別序列（Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly）。本研究以表達(dá)質(zhì)粒pET28a-hspB為模板，并由此設(shè)計(jì)正反向突變引物。P1：5'-GAAAACCTGTATTTTCAGGGCCACCACCACCACCACCAC-3’；P2：5'-GCCCTGAAAATACAGGTTTTCCTCGAGAAAGGTTTCCAT-3'。引物的5'端是TEV蛋白酶酶切識(shí)別序列對(duì)應(yīng)的核苷酸堿基序列（下劃線部分），3'端則是模板序列（P1的3'端是6×His標(biāo)簽的核苷酸堿基序列；P2的3'端是hspB基因3'端序列（GenBank登錄號(hào)GQ857548.1）。由生工生物工程（上海）有限公司合成引物。突變PCR反應(yīng)體系：FastPfu 聚合酶0.5μL，5×FastPfu Buffer 5μL，5×stimulant 5μL，2.5mmo/L dNTP 1.5μL，模板質(zhì)粒 0.5μL，上下游引物 0.5μL，以 ddH2O補(bǔ)至25μL。反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 3min，25 個(gè)循環(huán) ；72℃10min。產(chǎn)物鑒定：1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 重組質(zhì)粒pET28a-hspB-TEV-His的構(gòu)建 向20μL PCR 產(chǎn)物中加入 1μL Dpn I進(jìn)行消化，37℃，2h。將處理后的PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆。提取質(zhì)粒送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。經(jīng)Blast比對(duì)，測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒命名為pET28a-hspB-TEV-His。

1.2.3 HspB 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將pET28a-HspBTEV-His轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，于卡那霉素抗性平板上篩選陽性菌落。取陽性單菌落接種于50mL液體LB培養(yǎng)基中，加入終濃度為50mg/mL的卡那霉素，37℃，220r/min培養(yǎng)過夜，作為種子液。以1 100的接種量接種到1 L液體LB培養(yǎng)基中，加入終濃度為50mg/mL的卡那霉素，37℃，220r/min培養(yǎng)至OD600為0.8，加入終濃度為0.2mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG），16℃，180r/min誘導(dǎo)過夜。4℃，4 200r/min離心收集菌體。以1 L菌對(duì)應(yīng)20mL鎳柱平衡液（25mmol/L Tris pH8.0，300mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑）的比例重懸，并加入終濃度為100mg/L的抑肽酶、亮抑酶肽及250mg/L的苯甲基磺酰氟，混勻。

1.2.4 鎳柱親和層析 菌液于4℃進(jìn)行細(xì)胞破碎（1300 bar，3次）后，4℃，14000r/min離心，去上清過鎳柱兩遍。鎳柱漂洗液（25mmol/L Tris pH8.0，300mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑）漂洗柱子兩遍。鎳柱洗脫液（25mmol/L Tris pH8.0，300mmol/L NaCl，60mmol/L、200mmol/L咪 唑）5mL洗脫目的蛋白。SDS-PAGE分析。

1.2.5 TEV蛋白酶酶切 按酶與蛋白1 25的質(zhì)量比加入TEV蛋白酶進(jìn)行酶切。本研究中采用了兩種酶切方法。柱上酶切法：將蛋白上清掛柱后漂洗兩次，封閉柱子，然后加入5mL鎳柱漂洗液，按比例加入TEV蛋白酶，混勻柱料，4℃過夜。收集漂洗液。透析酶切法：在洗脫液中按比例加入TEV蛋白酶，置于透析袋中，于1 L鎳柱漂洗液（25mmol/L Tris pH8.0，300mmol/L NaCl，20mmol/L 咪唑）中 4℃漩渦過夜。

1.2.6 鎳柱除雜 在柱酶切法中直接收集酶切后漂洗液即可；透析酶切法則需要將透析液流穿鎳柱，收集流出液及漂洗液。兩種方法都需要用500mmol/L咪唑洗脫液洗脫柱上沒有酶切完全的蛋白和TEV酶，并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.7 凝膠過濾層析 預(yù)先用平衡緩沖液（25mmol/L Tris pH8.0，300mmol/L NaCl，2mmol/L DTT，1mmol/L EDTA）平衡 Superdex200 HiLoad 16/600 凝膠層析柱（流速1.0mL/min，壓強(qiáng)上限0.4 MPa）至電導(dǎo)曲線平直。將收集的流出液及漂洗液注入5mL上樣環(huán)中。用一個(gè)柱體積（約130mL）的平衡緩沖液洗脫并收集洗脫液。結(jié)合紫外吸收峰和SDSPAGE分析純化效果。4℃，4 500r/min離心濃縮蛋白溶液，Bradford法測(cè)定蛋白濃度至12mg/mL，直接進(jìn)行點(diǎn)晶或使用液氮速凍，并于-80℃保存。

1.2.8 SDS-PAGE分析 采用12％分離膠和5％濃縮膠制膠，電泳后使用考馬斯亮藍(lán)R250染色。

1.2.9 點(diǎn)晶 蛋白冰上解凍后，4℃，14000r/min離心5min后點(diǎn)晶。本實(shí)驗(yàn)采用懸滴擴(kuò)散法進(jìn)行結(jié)晶。使用48孔（24孔）結(jié)晶板，下槽孔中的結(jié)晶試劑為 80μL（160μL）。在硅化玻片上依次滴加 1μL 蛋白溶液和1μL結(jié)晶試劑，再將蓋玻片反扣覆蓋在池孔上并用凡士林密封空隙。恒溫靜置培養(yǎng)。定期在顯微鏡下觀察晶體生長(zhǎng)情況。

1.2.10 結(jié)晶條件優(yōu)化 以Index 2試劑盒的第83個(gè)條件為基礎(chǔ)，對(duì)結(jié)晶條件做進(jìn)一步優(yōu)化。優(yōu)化蛋白濃度：嘗試13.5、12、9.5和7.5mg/mL濃度蛋白進(jìn)行點(diǎn)晶。設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)pH、沉淀劑和鹽離子濃度進(jìn)行優(yōu)化：沉淀劑的濃度設(shè)置了以1％為單位，嘗試了12個(gè)梯度；鹽離子濃度以0.1mol/L為單位，嘗試了12 個(gè)梯度；pH以0.1為梯度嘗試了10個(gè)梯度；同時(shí)選擇了不同的沉淀劑（PEG200-10000）、鹽（各類鎂鹽及鹽酸鹽）和pH緩沖液成分（Mes、Bis-Tris和HEPES），確定最優(yōu)生長(zhǎng)條件。添加劑篩選：控制原結(jié)晶條件不變，在液滴中加入0.2μL添加劑（96種添加劑均來自Additive Screen試劑盒）后靜置培養(yǎng)。優(yōu)化培養(yǎng)溫度：嘗試4、8、14、18和20℃下培養(yǎng)晶體。最后也嘗試了微接種法，以獲得單晶。

2 結(jié)果

2.1 pET28a-hspB-TEV-His重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

突變PCR反應(yīng)后，擴(kuò)增產(chǎn)物由瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在4-8 kb間可見一條與pET28a-hspB-TEVHis質(zhì)粒理論大?。?.4 kb）相符的條帶（圖3）。該P(yáng)CR產(chǎn)物中包含環(huán)裝缺刻質(zhì)粒（目的產(chǎn)物）和痕量模板質(zhì)粒，經(jīng)Dpn I消化后轉(zhuǎn)化DH5α，挑取單菌落送測(cè)序，經(jīng)比對(duì)，序列完全正確。

圖3 pET28a-hspB-TEV-His重組質(zhì)粒構(gòu)建

2.2 HspB-TEV-His蛋白的鎳柱親和層析

菌體破碎后，離心收集上清，通過鎳柱親和層析純化，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，在45kD處有目的蛋白條帶（圖4），與預(yù)期（44.6kD）一致。上清、洗脫液中均有目的蛋白，60mmol/L咪唑下可見少許雜帶（66kD處），判斷可在之后的凝膠過濾層析中去除，故合并洗脫液?？梢姡撝亟M蛋白表達(dá)高、可溶性好且雜蛋白較少。

圖4 HspB-TEV-His蛋白的鎳柱親和層析

2.3 TEV蛋白酶酶切效果比較

柱上酶切法 經(jīng)SDS-PAGE分析（圖5），漂洗液中只有切除His標(biāo)簽的HspB（45kD），洗脫液中則存在酶切不完全仍帶有His標(biāo)簽的HspB-TEV-His（45kD）和TEV蛋白酶（27kD）。

透析酶切法 經(jīng)SDS-PAGE分析（圖5），流出液中有切除His標(biāo)簽的HspB蛋白和少量TEV蛋白酶，洗脫液中有未切開的HspB和TEV蛋白酶。

兩種酶切方法均可切除His標(biāo)簽，且保證較高的純度。對(duì)比兩者洗脫液，顯然在柱酶切中未切開的蛋白比透析酶切更多，說明透析酶切效率更高。

圖5 TEV蛋白酶酶切效果比較

2.4 HspB的凝膠過濾層析

Superdex200柱層析紫外吸收峰單一，峰型對(duì)稱陡峭，位置在56管（78.4mL）處，此處對(duì)應(yīng)于44kD，大小正確（圖6-A），取對(duì)應(yīng)峰位置的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，純化的蛋白為單一條帶（圖6-B），達(dá)到晶體初篩所要求的純度。收集峰尖位置左右的5管蛋白進(jìn)行濃縮。

圖6 HspB的凝膠過濾層析

2.5 HspB蛋白結(jié)晶條件初篩

經(jīng)過大量的初篩條件篩選后，在Index 2試劑盒（Hampton Research）的第83個(gè)條件下有晶體生長(zhǎng)，條件為25％ PEG3350，0.1mol/L Bis-Tris pH6.5，0.2mol/L MgCl2，14℃。晶體呈薄片狀，且有孿晶現(xiàn)象（圖7-A），不適合X-射線衍射數(shù)據(jù)收集，需要做進(jìn)一步的優(yōu)化工作。

2.6 HspB蛋白結(jié)晶條件優(yōu)化

確定的最優(yōu)結(jié)晶條件是蛋白濃度7.5mg/mL，22％ PEG3350，0.1mmol/L Bis-Tris pH6.5，0.21mol/L MgCl2，18℃，1 50的比例加入晶種，蛋白溶液與下槽液體積比為2 1的條件下，能夠獲得立體的塊狀單晶（圖7-B），該晶體在上海光源進(jìn)行X射線衍射后發(fā)現(xiàn)分辨率達(dá)到了1.8 ?。

圖7 HspB晶體的優(yōu)化

3 討論

本研究所采用經(jīng)典的QuickChange定點(diǎn)突變方法［19，20］（圖 2）：設(shè)計(jì)一對(duì)包含突變位點(diǎn)的引物，和模版質(zhì)粒退火后用Pfu聚合酶“循環(huán)延伸”（聚合酶按照模版質(zhì)粒延伸引物，一圈后回到引物5'端終止，再經(jīng)過反復(fù)加熱退火延伸的循環(huán)）。正反向引物的延伸產(chǎn)物退火后配對(duì)成為帶缺刻的開環(huán)質(zhì)粒。Dpn I酶切延伸產(chǎn)物，由于原來的模版質(zhì)粒來源于常規(guī)大腸桿菌，是經(jīng)dam甲基化修飾的，對(duì)Dpn I敏感而被切碎（Dpn I識(shí)別序列為甲基化的GATC，GATC在幾乎各種質(zhì)粒中都會(huì)出現(xiàn)，而且不止一次），而體外合成的帶突變序列的質(zhì)粒因無甲基化而未被切開，因此得以成功轉(zhuǎn)化（大腸桿菌體內(nèi)修復(fù)缺刻質(zhì)粒），即可得到突變質(zhì)粒的克?。?1］。前期實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了pET28a-HspB質(zhì)粒，表達(dá)純化得到HspB-His蛋白，用于結(jié)晶研究。由于晶體質(zhì)量較差，不能用于衍射［12］。蛋白C端序列存在超過30個(gè)氨基酸是非折疊區(qū)域（Foldindex預(yù)測(cè)），而這些氨基酸所形成的柔性肽段，會(huì)導(dǎo)致蛋白在構(gòu)象上的不均一，阻礙晶體的生長(zhǎng)［15］。然而完全或部分去除這些序列會(huì)導(dǎo)致蛋白不表達(dá)或沉淀（數(shù)據(jù)未顯示），暗示著該序列對(duì)于HspB結(jié)構(gòu)有著穩(wěn)定作用。因此本研究選擇去除其C端的His標(biāo)簽（6×His短肽也是柔性肽），以提升蛋白晶體的質(zhì)量。

前期實(shí)驗(yàn)嘗試插入凝血酶酶切序列，然后發(fā)現(xiàn)其無法被凝血酶切開。推測(cè)是由于其識(shí)別序列（Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser）較短，僅6個(gè)氨基酸，且前3個(gè)氨基酸（Leu、Val和Pro）均是非極性氨基酸，在表達(dá)時(shí)可能被折疊進(jìn)了蛋白疏水核，沒有暴露在水環(huán)境中［22］；或者是由于其酶切位點(diǎn)在Arg和Gly間，由于空間位阻，導(dǎo)致無法切除目的氨基酸［23］。

本研究總結(jié)了前期實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)，選擇了TEV蛋白酶作為工具酶，其主要考量在于：（1）其識(shí)別序列（Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly）更長(zhǎng)，為7個(gè)氨基酸，且除了Phe疏水外，其余氨基酸皆親水，不易被折疊進(jìn)疏水核內(nèi)；（2）其酶切位點(diǎn)位于Gln和Gly間，離蛋白更遠(yuǎn)，會(huì)減小空間位阻的影響。

TEV蛋白酶酶切時(shí)，需要解決了3個(gè)問題：（1）新增的步驟帶來的蛋白損失問題；（2）保持蛋白純度和性質(zhì)的問題；（3）純化路線的可操作性和時(shí)間問題。因此，本研究比較了柱上酶切和透析酶切的效率及純化效果發(fā)現(xiàn)，雖然在柱酶切比較省時(shí)省力，然而酶切效率較低，這可能是由于TEV蛋白酶與底物HspB蛋白都帶有His標(biāo)簽，因而結(jié)合在柱料上，發(fā)生的是固固反應(yīng)，分子間接觸幾率不如溶液反應(yīng)那么高，并且酶固定化后會(huì)降低酶活［24］；而透析酶切是溶液反應(yīng)，在酶切的同時(shí)進(jìn)行咪唑濃度的稀釋，可以節(jié)省時(shí)間，方便下一步的鎳柱除雜。因此最后選擇了透析酶切的策略。

蛋白的均一性是由鎳柱除雜和凝膠過濾層析來保證的。鎳柱除去了未切開的HspB蛋白，保證產(chǎn)物中僅有不帶標(biāo)簽的HspB蛋白，這是無法通過凝膠過濾層析實(shí)現(xiàn)的。均一性對(duì)于蛋白結(jié)晶的影響是很大的，因此為了保持最大均一性，只取凝膠過濾層析中紫外吸收峰半峰對(duì)應(yīng)的5管蛋白進(jìn)行濃縮點(diǎn)晶，而非整個(gè)紫外吸收峰對(duì)應(yīng)的蛋白［25］。這是由于均一性越高，其蛋白的大小形狀也越接近，在凝膠過濾層析中，也就越傾向于在同一位置出峰。

因此最終確定下來的純化路線能夠獲得純度高、較均一的HspB蛋白，并且沒有降解存在。同時(shí)整個(gè)純化過程都在4℃進(jìn)行，在最終保存液中也添加了二硫蘇糖醇以保護(hù)蛋白。

培養(yǎng)得到的單晶在上海光源進(jìn)行X射線衍射后發(fā)現(xiàn)，雖然分辨率達(dá)到了1.8 ?，但是在后續(xù)處理數(shù)據(jù)時(shí)發(fā)現(xiàn)其仍有孿晶趨勢(shì)，這可能是由于TEV蛋白酶酶切后留下的肽（Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln）具有一定的柔性所致，相比6×His標(biāo)簽，其在結(jié)晶條件（pH6.5）下帶電性更少，因而減少了同性相斥的現(xiàn)象，更利于蛋白分子有序堆積［26］。因此接下來將繼續(xù)優(yōu)化C端序列，進(jìn)一步提高其構(gòu)象均一性。底物的存在有利于晶體的生長(zhǎng)［27］，因此也將嘗試進(jìn)行與底物的共結(jié)晶，進(jìn)一步優(yōu)化晶體。HspB是惡臭假單胞菌尼古丁代謝通路中的關(guān)鍵酶，該途徑中其他酶的結(jié)構(gòu)多已見諸報(bào)道［28］，而HspB的結(jié)構(gòu)仍舊未知。了解HspB結(jié)構(gòu)不僅有助于理解其功能和結(jié)構(gòu)之間的聯(lián)系，完善整個(gè)吡咯途徑，還對(duì)定向進(jìn)化提高酶活及進(jìn)行工業(yè)化應(yīng)用具有積極的指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

本研究以惡臭假單胞菌HspB表達(dá)質(zhì)粒pET28a-HspB為模板，通過PCR插入TEV蛋白酶酶切序列，測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒pET28a-HspB-TEV-His。選用大腸桿菌BL21（DE3）進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)過鎳柱親和層析、TEV蛋白酶酶切、鎳柱除雜以及凝膠過濾層析獲得高純度蛋白。

優(yōu)化結(jié)晶條件后，確定了單晶培養(yǎng)條件是蛋白濃 度 7.5mg/mL，22％PEG3350、0.1mol/L Bis-Tris pH6.5、0.21mol/L MgCl2，18℃，以1 50的比例加晶種，蛋白溶液與下槽液體積比為2 1的條件；單晶的分辨率達(dá)到1.8 ?。

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