葛少欽葛雪凝趙崢輝王 燕△劉梅云

1. 河北大學(xué)（保定 071000）； 2. 河北大學(xué)附屬醫(yī)院；

3. 河北大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究所； 4. 河北省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究院

·研究簡訊·

不明原因不育患者精子頭部空泡超微結(jié)構(gòu)研究*

葛少欽1-4葛雪凝1趙崢輝1王 燕1△劉梅云2△

1. 河北大學(xué)（保定 071000）； 2. 河北大學(xué)附屬醫(yī)院；

3. 河北大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究所； 4. 河北省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究院

研究表明，不孕不育夫婦數(shù)量正逐步增加［1］，據(jù)統(tǒng)計，全世界大約有15%～20%的育齡夫婦存在生育障礙，而男性原因?qū)е虏挥谋壤?0%～50%［2］。其中精子形態(tài)異常、精子畸形率增加是導(dǎo)致男性不育的重要原因［3］。當(dāng)前許多學(xué)者試圖從精子頂體畸形、精子DNA斷裂與損傷、精子染色體異常等評價精子頭部空泡與精子功能缺陷的關(guān)系［4］，但至今精子頭部空泡分類并沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，空泡的本質(zhì)尚屬未知領(lǐng)域。本文利用透射電鏡，觀察正常生育力男性和不明原因不育患者精子頭部空泡超微結(jié)構(gòu)，對比常規(guī)電鏡包埋材料與僅用戊二醛固定和醋酸鈾染色處理的電鏡材料，分析精子頭部空泡化學(xué)組成，在一定程度上明確精子頭部空泡對精子質(zhì)量影響的本質(zhì)，探討不明原因性不育患者的不育原因。

材料與方法

一、受試對象

在河北大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科隨機選取25～45周歲不明原因的不育患者8例，無特殊病史，體格檢查正常，無輸精管阻塞、腮腺炎病毒感染、隱睪、營養(yǎng)不良、內(nèi)分泌紊亂和精索靜脈曲張等，精液液化正常，抗精子抗體陰性；女方皆為原發(fā)不孕，經(jīng)婦科B超、子宮輸卵管造影、內(nèi)分泌水平、抗精子抗體、抗心磷脂抗體及抗內(nèi)膜抗體檢查，結(jié)果均正常；對照隨機選取結(jié)婚2年、孕育有孩子的正常生育男性3例。

二、標(biāo)本采集和處理

禁欲3～7d，室溫約25～30℃的實驗室，由供精者按摩取精。精液液化后，依據(jù)第五版《世界衛(wèi)生組織人類精液分析實驗室技術(shù)手冊》［5］標(biāo)準(zhǔn)行精液常規(guī)檢查，剩余精液450×g，離心10min，沉淀精子用瓊脂糖進行預(yù)包埋，一部分用于常規(guī)電鏡材料處理（雙染），另一部分用于戊二醛單固定和醋酸鈾單染電鏡材料處理（單染）。

（一）常規(guī)電鏡材料處理（雙染）

1. 前固定：瓊脂糖預(yù)包埋精子放入裝有適量前固定液1mL的小離心管中進行固定。固定液為2.5%多聚甲醛+0.1mol/L、pH 7.2的PBS緩沖液，于4℃固定2h。

2. 漂洗：4℃下，0.1mol/L、pH 7.2的PBS緩沖液漂洗3次，每次10min。

3. 后固定：固定液為1%的鋨酸+ 0.1mol/L、pH 7.2的PBS緩沖液，于4℃固定1h。

4. 再漂洗：4℃下，0.1mol/L、pH 7.2的PBS緩沖液漂洗3次，每次10min。

5. 酒精系列脫水：在30%、50%、70%、85%、95%酒精中各10min，再在100%酒精、丙酮各兩次，每次10min。

6. 滲透：環(huán)氧樹脂Epon812與丙酮按1:1混合對材料進行滲透2h，然后轉(zhuǎn)入純環(huán)氧樹脂Epon812滲透，過夜。

7. 包埋聚合：環(huán)氧樹脂Epon812包埋，60℃聚合48h。

8. 超薄切片：半薄切片定位后，超薄切片（70～90）nm撈在銅載網(wǎng)上。

9. 雙染：對材料進行醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色。

10. 漂洗：雙蒸水漂洗3次，每次1min，自然干燥。

11. 觀察：用JEM-100SX透射電鏡（75kV）對材料進行觀察，拍照。

（二）戊二醛單固定醋酸鈾單染電鏡材料處理（單染）

1. 前固定：瓊脂糖預(yù)包埋精子放入裝有適量前固定液的1ml的小離心管中進行固定。固定液：2.5%多聚甲醛+0.1mol/L pH 7.2的PBS緩沖液，于4℃固定2h。

2. 漂洗：4℃下，0.1mol/L pH 7.2的PBS緩沖液漂洗3次，每次10min。

3. 酒精系列脫水：在30%、50%、70%、85%、95%酒精中各10min，再在100%酒精、丙酮各兩次，每次10min。

4. 滲透：環(huán)氧樹脂Epon812與丙酮按1:1混合對材料進行滲透2h，然后轉(zhuǎn)入純環(huán)氧樹脂Epon812滲透，過夜。

5. 包埋聚合：環(huán)氧樹脂Epon812包埋，60℃聚合48h。

6. 超薄切片：半薄切片定位后，超薄切片（70～90nm）撈在銅載網(wǎng)上。

7. 單染：對材料進行醋酸鈾染色。

8. 漂洗：雙蒸水漂洗3次，每次1min，自然干燥。

9. 觀察：用JEM-100SX透射電鏡（75kV）對材料進行觀察，拍照。

結(jié) 果

依據(jù)第五版《世界衛(wèi)生組織人類精液分析實驗室技術(shù)手冊》［5］，精液參數(shù)參考值下限：精液體積1.5 mL，精子濃度15×106/mL，總活力［前向運動精子（PR）+非前向運動精子（NP）］ 40%，PR 32%，存活率58%，正常形態(tài)4%，pH≥7.2，液化時間（min）≤60，同時達到上述標(biāo)準(zhǔn)者為正常精液。

8例不明原因不育患者和3例正常生育力男性精液常規(guī)分析，其參數(shù)都在正常范圍內(nèi)（表1）；常規(guī)處理的電鏡材料，精子頭部空泡中清晰可見FP、膜螺旋體（MW）和髓樣體（MB），顆粒物質(zhì)與膜結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核電子密度較高，頂體深染（圖1AD）；僅用戊二醛固定、醋酸鈾單染處理的電鏡材料，精子頭部空泡中無顆粒物質(zhì)與膜型結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核電子密度低，頂體著色淺（圖1E，圖1F）。

表 1 8例不明原因不育患者和3例正常生育力男性精液分析結(jié)果

圖1 電鏡下觀察不育患者精子頭部空泡超微結(jié)構(gòu)A-D為常規(guī)處理的電鏡觀察材料； E、F為僅用戊二醛固定、醋酸鈾單染處理的觀察材料； 其中A: 含有高電子密度絮狀顆粒（FP）物質(zhì)的無膜空泡和沒有具體結(jié)構(gòu)、無膜的小空泡（箭頭所指）； B: 包含膜螺旋體（MW）和絮狀顆粒FP內(nèi)含物的空泡； C: 包含膜螺旋體MW空泡； D: 包含膜螺旋體MW與髓樣體（MB）的空泡； E， F: 戊二醛固定和醋酸鈾染色處理材料精子， 精子頭部空泡（V）無膜結(jié)構(gòu)（MW/MB）與FP， 內(nèi)含物電子密度低

討 論

精子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能異常是男性不育的重要原因之一。精子形態(tài)學(xué)檢查在輔助生殖技術(shù)中具有重要意義，第五版《世界衛(wèi)生組織人類精液分析實驗室技術(shù)手冊》對精子正常形態(tài)有嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)［5］。目前臨床上一直把精液常規(guī)作為男性生殖學(xué)檢查的一項重要而又基本的指標(biāo)，鑒于其局限在光鏡下觀察，無法對精子結(jié)構(gòu)和功能進行準(zhǔn)確的判斷。在臨床精液分析中，特別是對于一些原因不明的不育癥患者，常規(guī)精液分析參數(shù)正常并不能完全反映其疾病原因信息。透射電鏡基于其高分辨率，能夠清晰觀察精子的各種超微結(jié)構(gòu)，可對光學(xué)顯微鏡無法觀察到的精子病變加以識別，在精子質(zhì)量評價中，具有光鏡無可比擬的優(yōu)點，是目前精子形態(tài)與結(jié)構(gòu)檢測最客觀可信的依據(jù)［5］。

精子結(jié)構(gòu)完整性是其生殖功能的基礎(chǔ)，精子形態(tài)及結(jié)構(gòu)檢查對臨床男性不育的診斷、治療和預(yù)后評價具有重要意義。通過對正常生育力男性和不明原因不育患者常規(guī)電鏡處理材料研究觀察，發(fā)現(xiàn)正常生育力男性精子頭部長寬比例合適，質(zhì)膜和頂體完整，線粒體排列有序，微管清晰可見9+2結(jié)構(gòu)，頭部無或有少量無具體結(jié)構(gòu)的空泡（圖2）；而不明原因不育患者精子頭部空泡十分多發(fā)，且主要位于精子頭部的前中區(qū)域，并存在異質(zhì)性，按其超微結(jié)構(gòu)可分為5種類型（圖1A-D）：含有高電子密度絮狀顆粒（Flocculent particles， FP）物質(zhì)的無膜空泡；包含膜螺旋體（Membrane whorls， MW）和絮狀顆粒FP內(nèi)含物的空泡；包含膜螺旋體MW與髓樣體（Myelinbody， MB）的空泡；僅包含膜螺旋體MW的空泡和沒有具體結(jié)構(gòu)、無膜的小空泡（箭頭所指），這與Zhang等［6］的研究結(jié)果相一致。一般存在較大頭部空泡的精子細(xì)胞核濃縮程度低且不再呈橢圓形結(jié)構(gòu)，頂體凹凸欠平滑、腫脹或呈波浪形改變（圖1A，圖1C，圖1D）。

圖2 正常生育力男性精子常規(guī)電鏡處理材料（A）與僅用戊二醛固定和醋酸鈾染色處理材料（B）A: 精子頭部長寬比例合適， 精子質(zhì)膜和頂體完整， 細(xì)胞核存在一個結(jié)構(gòu)較小的空泡， 尾部線粒體排列整齊， 微管清晰可見， 9+2結(jié)構(gòu)完整； B:精子頭部長寬比例合適， 精子質(zhì)膜和頂體完整， 細(xì)胞核無空泡， 尾部線粒體排列整齊， 微管可見， 細(xì)胞核與頂體淺染

分析電鏡材料的處理過程，各種試劑的搭配運用保證了對生物材料中糖、脂、蛋白質(zhì)及核酸的充分固定與染色。其中戊二醛可固定糖，不固定脂；而鋨酸可固定脂，不固定糖，兩種固定劑都能固定蛋白質(zhì)；醋酸鈾對核酸物質(zhì)及細(xì)胞膜染色效果好，而檸檬酸鉛適用于對核糖體、糖原、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)染色，另外與含有還原鋨的物質(zhì)有強親和力。只經(jīng)過戊二醛單固定材料，在用酒精與丙酮脫水過程中，脂類物質(zhì)將被抽提。我們將只經(jīng)過戊二醛單固定和醋酸鈾單染的材料（圖2B；圖1E，圖1F）與常規(guī)電鏡材料（圖2A， 圖1A-D）進行對比，發(fā)現(xiàn)正常生育力精子細(xì)胞核與頂體淺染，不明原因性不育精子頭部空泡中均無脂質(zhì)膜環(huán)層與髓樣體，認(rèn)為其中脂類物質(zhì)在脫水過程中已經(jīng)被抽提掉，僅存在相對高電子密度的蛋白顆粒物質(zhì)，表明精子頭部空泡包含了脂類、蛋白質(zhì)類與核酸類物質(zhì)。多種研究顯示空泡的發(fā)生與精子形成晚期精-組蛋白替換不完全導(dǎo)致染色質(zhì)濃縮異常有關(guān)［7，8］。精子空泡可能包含精子形成過程中本該移除的組蛋白、未參與DNA包裝的精蛋白、調(diào)控精子發(fā)生及早期胚胎發(fā)育的非編碼RNA（如lncRNA）等［9，10］。Garolla等［11-13］研究發(fā)現(xiàn)單獨選擇出的含有大空泡或幾個大或小空泡的精子存在高水平的DNA損傷；Hammoud等［14］發(fā)現(xiàn)具有前部或后部空泡的正常精子（大小不定）比無空泡的正常精子的DNA斷裂水平要高很多（前部空泡15.9%，后部空泡22.5% vs. 無空泡精子4.1%，前部P＜0.05，后部P＜0.001），表明空泡的大小和部位不同所提示的染色質(zhì)濃縮異常程度和DNA斷裂水平不一。研究已經(jīng)證實大精子空泡與染色質(zhì)濃縮失敗緊密相關(guān)［8］，其可能造成高水平的精子DNA損傷，導(dǎo)致胚胎發(fā)育過程中父系基因組表達異常，無法在4～8細(xì)胞階段完成對胚胎基因組的激活，使胚胎發(fā)育停滯等［15］，此外延時分析表明，與空泡精子發(fā)育成的囊胚相比，無空泡精子囊胚發(fā)育過程所需平均時間最短［16］。

盡管不同精子空泡的大小、數(shù)量和部位不同，其染色質(zhì)濃縮異常程度不同，所造成的DNA損傷水平不一，會導(dǎo)致精子空泡與染色質(zhì)濃縮異常關(guān)聯(lián)程度的偏倚［12，14］，但電鏡下發(fā)現(xiàn)不明原因不育患者精子頭部空泡十分多發(fā)，提示其染色質(zhì)濃縮失敗，精子DNA存在一定程度的損傷，這可能是不明原因嚴(yán)重少弱精子癥患者不育的原因之一。精子頭部空泡多發(fā)將會降低受精率、妊娠率和胚胎質(zhì)量，并誘發(fā)高流產(chǎn)率［7］，建議不明原因不育患者增加常規(guī)透射電鏡精子檢查項目，條件允許情況下可選擇頭部無或/少或/小空泡精子進行IMSI（Intracytoplasmic Morphologically Selected Sperm Injection）輔助生殖技術(shù)。至于精子頭部空泡中的具體脂質(zhì)分類、蛋白質(zhì)分布、核酸組成，空泡大小、多少及其存在部位等導(dǎo)致精子功能缺陷的閾值，精子頭部空泡對受精、胚胎發(fā)育影響的分子機制等，尚有待于進一步研究。

不育，男性； 精子/超微結(jié)構(gòu)

1 Marchesi DE， Feng HL. Sperm DNA integrity from sperm to egg. J Androl 2007； 28（4）: 481-489

2 朱健生， 季 鋼， 張 玲， 等. 卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)在男性不育癥的臨床應(yīng)用. 中國優(yōu)生與遺傳雜志2008； 16（9）: 106-107

3 Yu JJ， Xu YM. Ultrastructural defects of acrosome in infertile men. Arch Androl 2004； 50（6）: 405-409

4 Baccetti B， Collodel G， Piomboni P. Apoptosis in human ejaculated sperm cells （notulae seminologicae 9）. J Submicrose Cytol Patbol 1996； 28（4）: 587-596

5 World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th ed. Geneva: World Health Organization， 2010

6 Zhang S， Wang N， He B， et al. Sperm head vacuoleslight microscopic and ultrastructural observations: a case report. Ultrastruct Pathol 2012； 36（3）: 185-188

7 Boitrelle F， Albert M， Petit JM， et al. Small human sperm vacuoles observed under high magnifi cation are pocketlike nuclear concavities linked to chromatin condensation failure. Reprod Biomed Online 2013； 27（2）: 201-211

8 Boitrelle F， Ferfouri F， Petit JM， et al. Large human sperm vacuoles observed in motile spermatozoa under high magnification: nuclear thumbprints linked to failure of chromatin condensation. Hum Reprod 2011；26（7）: 1650-1658

9 Jodar M， Selvaraju S， Sendler E， et al. The presence， role and clinical use of spermatozoal RNAs. Hum Reprod Update 2013； 19（6）: 604-624

10 Tsai MC， Manor O， Wan Y， et al. Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modifi cation complexes. Science 2010； 329（5992）: 689-693

11 Garolla A， Fortini D， Menegazzo M， et al. High-power microscopy for selecting spermatozoa for ICSI by physiological status. Reprod Biomed Online 2008； 17（5）: 610-616

12 Franco JG Jr， Baruffi RL， Mauri AL， et al. Signifi cance of large nuclear vacuoles in human spermatozoa: implications for ICSI. Reprod Biomed Online 2008； 17（1）: 42-45

13 Wilding M， Coppola G， di Matteo L， et al. Intracytoplasmic injection of morphologically selected spermatozoa （IMSI）improves outcome after assisted reproduction by deselecting physiologically poor quality spermatozoa. J Assist Reprod Genet 2011； 28（3）: 253-262

14 Hammoud I， Boitrelle F， Ferfouri F， et al. Selection of normal spermatozoa with a vacuole-free head （x6300）improves selection of spermatozoa with intact DNA in patients with high sperm DNA fragmentation rates. Andrologia 2013； 45（3）: 163-170

15 Braude P， Bolton V， Moore S. Human gene expression fi rst occurs between the four- and eight-cell stages of preimplantation development. Nature 1988； 332（6163）: 459-461

16 Knez K， Tomazevic T， Vrtacnik-Bokal E， et al. Developmental dynamics of IMSI-derived embryos: a time-lapse prospective study. Reprod Biomed Online 2013； 27（2）: 161-171

（2015-06-13收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.09.014

R 698.2

資助: 河北省自然科學(xué)基金資助項目（編號：H2013201259）；河北省2013留學(xué)回國人員科研活動項目（編號：C2013005002）；國家第48批“留學(xué)回國人員科研啟動基金”（編號：702850515001）

△通訊作者， 王燕， E-mail: wyry2004@163.com； 劉梅云， E-mail: lmydoctor2007@sina.com