馬 強(qiáng)申 琴焦海燕

1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)系（銀川 750004）；

2. 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科； 3. 寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

精子DNA完整性和 hOGG1 rs1052133與原發(fā)性男性不育的相關(guān)性研究*

馬 強(qiáng)1，2△申 琴1，3△焦海燕1，3**

1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)系（銀川 750004）；

2. 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科； 3. 寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的 探討人類8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶（human 8-hydroxyguanine deoxyribonucleic acid glycosidase，hOGG1）基因rs1052133（Cys326Ser）及精子DNA完整性對(duì)原發(fā)性男性不育的影響。方法 收集2011年8月至2012年12月間在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院就診的332例原發(fā)性男性不育患者和329例健康體檢者分別作為病例組和對(duì)照組，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)檢測(cè)兩組人群hOGG1 rs1052133基因型；采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)（SCD）檢測(cè)病例組和對(duì)照組精子DNA損傷程度。分析精子DNA完整性與精液參數(shù)的相關(guān)性以及hOGG1 rs1052133不同基因型與原發(fā)性男性不育的相關(guān)性以及對(duì)精子DNA完整性的影響。結(jié)果 原發(fā)性男性不育患者精子DNA碎片指數(shù)（DFI）高于對(duì)照組；原發(fā)性男性不育患者精子DFI與前向運(yùn)動(dòng)精子和非前向運(yùn)動(dòng)精子呈負(fù)相關(guān)（r =-0.35和-0.13，P＜0.05），與不動(dòng)精子呈正相關(guān)（r =0.24，P＜0.05）；攜帶hOGG1 rs1052133CC基因型的個(gè)體患原發(fā)性少弱精子癥的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶GG型個(gè)體的1.93倍。rs1052133與吸煙和飲酒與原發(fā)性男性不育的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)交互作用，同時(shí)該位點(diǎn)三種不同基因型的患者間精子DFI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 原發(fā)性男性不育患者精子DNA完整性降低，并且精子DNA損傷可導(dǎo)致精液質(zhì)量下降，是原發(fā)性男性不育的病因之一。 hOGG1 rs1052133CC基因型可能是原發(fā)性男性不育的危險(xiǎn)因素，但該位點(diǎn)可能不影響精子DNA完整性。

人類8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶； 多態(tài)性， 單核苷酸； 不育， 男性

精子發(fā)生是一個(gè)連續(xù)的、多步驟的過(guò)程，并且持續(xù)存在于內(nèi)源性和外源性活性氧（ROS）如超氧化物陰離子和過(guò)氧化氫物質(zhì)中。氧化應(yīng)激可導(dǎo)致精子細(xì)胞膜和精子核DNA和線粒體DNA斷裂［1］，通過(guò)影響精子質(zhì)量繼而降低男性生育力。然而，精子細(xì)胞內(nèi)缺乏一系列的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)，根據(jù)不同的DNA損傷類型，機(jī)體啟動(dòng)相應(yīng)的修復(fù)途徑完成受損精子DNA的修復(fù)，其中堿基切除修復(fù)是主要的修復(fù)途徑之一。

人類8-羥基鳥嘌呤糖苷酶1（hOGG1）是堿基切除修復(fù)途徑中的關(guān)鍵酶，它具有糖苷酶和脫嘌呤或脫嘧啶裂解酶雙重活性，能特異地切除DNA氧化性損傷的特異性產(chǎn)物8-羥基鳥嘌呤［2］。hOGG1基因表達(dá)具有組織特異性，在人類睪丸和胚胎組織中表達(dá)最高，對(duì)于防止精子基因突變和胚胎免受氧化損傷是必不可少的［3］。人類hOGG1基因中存在較多的多態(tài)性位點(diǎn)，其中rs1052133（G/C，Cys/Ser）是目前研究較多的一個(gè)，但其主要集中在與腫瘤的遺傳易感性方面［4-7］，鮮見(jiàn)其與原發(fā)性男性不育的研究。因此，本研究主要探討精子DNA損傷及hOGG1基因 rs1052133對(duì)原發(fā)性男性不育的影響，為原發(fā)性男性不育的病因?qū)W研究及預(yù)防提供依據(jù)。

材料與方法

一、研究對(duì)象納入

按照知情同意原則，收集2011年8月至2012年12月間在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院就診的332例原發(fā)性男性不育患者和329例健康體檢者（均有自然生育史），其中原發(fā)性不育患者包括非梗阻性無(wú)精子癥87例、少弱精子癥166例和精液正常的男性不育79例。采集所有研究對(duì)象2mL靜脈血，收集上述不育患者和30例正常生育男性（對(duì)照組）精液一份，并調(diào)查其吸煙、飲酒狀況。

二、精液常規(guī)分析

按照《WHO人類精液檢驗(yàn)與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（第五版）》的要求，采用全自動(dòng)精子分析系統(tǒng)檢測(cè)原發(fā)性男性不育患者和對(duì)照組精子濃度、精子活力等精液常規(guī)參數(shù)。

三、精子DNA損傷程度檢測(cè)

運(yùn)用精子染色質(zhì)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)［8］檢測(cè)少弱精子癥和精液正常不育患者的精子DNA損傷程度。計(jì)數(shù)300個(gè)以上精子細(xì)胞，觀察精子光暈大小。根據(jù)光暈與精子頭部橫徑的比例，粗分為大、中、小和無(wú)光暈4個(gè)等級(jí)。小光暈以精子頭直徑≤1/3為判斷標(biāo)準(zhǔn)；中光暈精子頭直徑＞1/3，而≤2/3；大光暈精子頭直徑＞2/3。大和中光暈表示精子DNA完整無(wú)碎片，小和無(wú)光暈表示精子DNA斷裂為碎片。精子DNA損傷程度用精子DNA碎片指數(shù)（DFI）表示，DFI=（小光暈精子數(shù)+無(wú)光暈精子數(shù)）/總數(shù)×100%。

四、hOGG1 rs1052133基因型分析

采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)檢測(cè)不育患者和健康體檢者h(yuǎn)OGG1基因 rs1052133位點(diǎn)基因型。

（一）血液基因組DNA提取

用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的血液基因組提取試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書步驟提取研究對(duì)象的血液基因組DNA，儲(chǔ)存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

（二）PCR擴(kuò)增

［9］報(bào)道的引物序列（Forward Primer：5′-TTGCCTTCGGCCCTGTTCCCCAAGGA-3′，Reverse Primer：5′-TTGCTGGTGGCTCCTGAGCA TGGCCG-3′）擴(kuò)增包含rs1052133位點(diǎn)在內(nèi)的一段DNA序列。擴(kuò)增體系（12.5μL）：2×Master Mix 6.25μL，Taq DNA polymerase（5U/μL）0.125μL，F(xiàn)orward Primer（10μmol/L）0.25μL，Reverse Primer（10μmol/L）0.25μL，DNA Template 1μL，ddH2O 4.625μL。擴(kuò)增條件：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，34 Cycles ；72℃ 10min。擴(kuò)增產(chǎn)物儲(chǔ)存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

（三）RFLP 技術(shù)檢測(cè)原發(fā)性男性不育組和對(duì)照組hOGG1 rs1052133基因型

采用NEB公司生產(chǎn)的MspⅠ限制性內(nèi)切酶，嚴(yán)格按照說(shuō)明書步驟對(duì)上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切完成后，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，并在Syngene 凝膠成像儀下觀察并記錄結(jié)果，判斷基因型。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、精液常規(guī)參數(shù)

如表1所示，少弱精子癥組患者精子濃度和前向運(yùn)動(dòng)精子百分?jǐn)?shù)均低于精液正常不育組和對(duì)照組，而非前向運(yùn)動(dòng)精子和不動(dòng)精子百分?jǐn)?shù)高于精液正常不育組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而精液正常不育組和對(duì)照組相比，精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子、非前向運(yùn)動(dòng)精子和不動(dòng)精子百分?jǐn)?shù)均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

二、精子DNA損傷程度

少弱精子癥組、精液正常不育組和對(duì)照組中，精子DFI分別為（50.0±22.1）%、（38.2±20.7）%和（21.4±9.2）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

三、原發(fā)性男性不育患者精子DFI與精子活力的相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示，原發(fā)性男性不育患者精子DFI與前向運(yùn)動(dòng)精子百分率和非前向運(yùn)動(dòng)精子百分率呈負(fù)相關(guān)（r =-0.35和-0.13，P＜0.05），與不動(dòng)精子百分率呈正相關(guān)（r =0.24，P＜0.05），見(jiàn)圖2。

表1 少弱精子癥組和精液正常不育組精液常規(guī)參數(shù)

圖1 原發(fā)性男性不育組和對(duì)照組精子DFI比較（%）（P＜0.05）

圖2 原發(fā)性男性不育患者精子DFI與前向運(yùn)動(dòng)精子、非前向運(yùn)動(dòng)精子和不動(dòng)精子的相關(guān)性A: 原發(fā)性男性不育患者精子DFI與前向運(yùn)動(dòng)精子的相關(guān)性； B: 原發(fā)性男性不育患者精子DFI與非前向運(yùn)動(dòng)精子的相關(guān)性； C: 原發(fā)性男性不育患者精子DFI與不動(dòng)精子的相關(guān)性

四、hOGG1 rs1052133與原發(fā)性男性不育的相關(guān)性研究

（一）hOGG1 rs1052133位點(diǎn)PCR擴(kuò)增及PCRRFLP進(jìn)行基因型分析

參考文獻(xiàn)合成PCR引物（上海生工生物工程有限公司合成），其中上游引物為5′-TTGCCTTCGGC CCTGTTCCCCAAGGA-3′，下游引物為5′-TTGCT GGTGGCTCCTGAGCATGGCcG-3′，PCR反應(yīng)體系（12.5μL）為：2× Master Mix 6.25μL，Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.125μL，上游引物（10μmol/L）0.25μL，下游引物（10μmol/L）0.25μL，ddH2O 4.625μL，DNA模板（50ng/μL）1μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，若rs1052133位點(diǎn)為C時(shí)，則能被MspⅠ酶識(shí)別并切開(kāi)；若rs1052133位點(diǎn)為G時(shí)，則不能被MspⅠ酶識(shí)別。因而，rs1052133 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切孵育后可產(chǎn)生168bp、142bp、26bp三個(gè)片段，根據(jù)電泳結(jié)果判斷基因型（圖3）：CC型142bp、26bp，CG型168bp、142bp、26bp，GG型168bp。由于26bp片段太小，電泳時(shí)已經(jīng)泳出瓊脂糖凝膠，無(wú)法觀察到。每種基因型的個(gè)體各挑選2例，PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示，酶切分型和測(cè)序完全一致，提示酶切分型結(jié)果可靠。

圖3 rs1052133經(jīng)BslⅠ酶切后電泳圖M泳道: DNA maker； 1， 2泳道: GG基因型； 3， 6泳道: CC基因型； 4，5泳道: CG基因型

（二）hOGG1 rs1052133與原發(fā)性男性不育的相關(guān)性

原發(fā)性男性不育組和對(duì)照組中hOGG1 rs1052133三種基因型頻率分布具有顯著性差異（P＜0.05），攜帶CC基因型的個(gè)體患原發(fā)性男性不育的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶GG型的個(gè)體的1.81倍（OR=1.81，95%CI：1.10-3.00）；而G、C等位基因頻率在兩組中的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。進(jìn)一步的分層分析發(fā)現(xiàn)，hOGG1 rs1052133與無(wú)精子癥和精液正常的男性不育無(wú)相關(guān)性，與原發(fā)性少弱精子癥顯著相關(guān)，攜帶CC基因型的個(gè)體患原發(fā)性少弱精子癥的風(fēng)險(xiǎn)是GG型個(gè)體的1.93倍（表2）。

五、hOGG1 rs1052133不同基因型間精子DFI比較

分析顯示，攜帶rs1052133 GG、CG、CC三種不同基因型個(gè)體間精子DFI分別為（48.1±22.4）%、（43.3±21.8）%和（48.8±23.1）%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖4）。

六、hOGG1 rs1052133與吸煙飲酒的交互作用對(duì)原發(fā)性男性不育的影響

通過(guò)單純病例研究發(fā)現(xiàn)，hOGG1 rs1052133與吸煙和飲酒對(duì)原發(fā)性男性不育的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)交互作用（P＞0.05）。

表2 hOGG1 rs1052133與原發(fā)性少弱精子癥的相關(guān)性

圖4 攜帶rs1052133三種不同基因型的個(gè)體精子DFI比較

討 論

精子是遺傳物質(zhì)的攜帶者，其質(zhì)量對(duì)受精能力和胚胎質(zhì)量均有較大的影響［10，11］。臨床上常用的評(píng)價(jià)精子質(zhì)量的指標(biāo)有精子濃度、精子活力、精子活率和精子形態(tài)等，但這些指標(biāo)不能完全反映精子質(zhì)量。在體內(nèi)，精子會(huì)受到睪丸內(nèi)外因素的影響而造成DNA斷裂，如果受損精子DNA得不到及時(shí)有效地修復(fù)，則可導(dǎo)致男性生育力下降，甚至不育。本研究結(jié)果表明，原發(fā)性男性不育患者精子DNA損傷程度高于生育男性，并且其精子DFI與前向運(yùn)動(dòng)精子百分率和非前向運(yùn)動(dòng)精子百分率呈負(fù)相關(guān)，與不動(dòng)精子百分率呈正相關(guān)，提示不育患者精子DNA完整性降低，并且隨著精子DFI增高，精子活力呈下降趨勢(shì)，與文獻(xiàn)報(bào)道的一致［12，13］，因此，精子SCD實(shí)驗(yàn)可作為評(píng)價(jià)精子質(zhì)量的新指標(biāo)。

精子DNA在受到體內(nèi)外有害物質(zhì)的損傷后，機(jī)體會(huì)啟動(dòng)DNA損傷動(dòng)修復(fù)系統(tǒng)，其中最重要的是堿基切除修復(fù)和核苷酸切除修復(fù)。人類基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）是第三代遺傳標(biāo)記，同時(shí)它也是不同個(gè)體基因功能差異的重要遺傳學(xué)基礎(chǔ)。人類DNA損傷修復(fù)基因的SNP可能會(huì)影響其蛋白功能，導(dǎo)致不同個(gè)體修復(fù)能力不同，使其修復(fù)受損DNA的能力下降，導(dǎo)致基因組完整性降低而影響細(xì)胞功能。男性精子DNA損傷可表現(xiàn)為精子質(zhì)量下降，受精能力降低，甚至不育。hOGG1基因rs1052133可以導(dǎo)致Ser/Cys氨基酸改變，影響hOGG1酶的活性，降低其DNA修復(fù)能力。rs1052133是腫瘤遺傳易感性研究的熱點(diǎn)，單個(gè)研究和Meta 分析均顯示其與多種腫瘤相關(guān)［14-18］，然而rs1052133與男性不育的研究較少見(jiàn)。Ji等［19］的研究表明，在顯性遺傳模型下，rs1052133CG+GG基因型的個(gè)體患原發(fā)性男性不育的風(fēng)險(xiǎn)增加。而本研究顯示，攜帶rs1052133CC基因型的個(gè)體患原發(fā)性男性不育的風(fēng)險(xiǎn)是GG基因型的1.81倍（OR=1.81，95%CI=1.10-3.00）。本研究結(jié)果與Ji等的結(jié)果相反，可能主要由于研究對(duì)象的納入差異。Ji等的病例組納入了620例原發(fā)性男性不育患者，未納入無(wú)精子癥患者，而本研究的病例組中包含了87例無(wú)精子癥患者。此外，本研究與hOGG1 rs1052133位點(diǎn)的功能學(xué)研究也有所不同。研究發(fā)現(xiàn)［20］，OGG1-Ser326（CC）轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞比OGG1- Cys326（GG）轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞能更高效地抑制8-oxo-Gua 誘導(dǎo)的突變，因此人細(xì)胞OGG1-Cys326 修復(fù)8-oxo-Gua 所致突變的能力弱于OGG1-Ser326，而本研究顯示在群體水平hOGG1 rs1052133CC基因型是原發(fā)性男性不育的危險(xiǎn)因素。

本研究也表明，雖然hOGG1 rs1052133 CC基因型是原發(fā)性男性不育的危險(xiǎn)性因素，但是與CG、CC兩種基因型相比，CC基因型患者的精子DFI并無(wú)差異，提示hOGG1 rs1052133對(duì)精子DNA損傷程度無(wú)影響。同時(shí)，hOGG1 rs1052133位點(diǎn)與吸煙和飲酒對(duì)原發(fā)性男性不育無(wú)交互作用。DNA損傷修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的通路，其中涉及到多條信號(hào)通路和多個(gè)關(guān)鍵基因的共同作用，本研究所選擇的位點(diǎn)可能起微效作用，其他基因的共同作用可能參與了精子DNA損傷的修復(fù)。因此，其他DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的SNP位點(diǎn)與精子DNA損傷的關(guān)系還有待于進(jìn)一步的研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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（2015-07-28收稿）

Correlation analysis of sperm DNA integrity/hOGG1 rs1052133 and primary male infertility*

Ma Qiang1，2△， Shen Qin1，3△， Jiao Haiyan1，3**
1. Department of Medical Genetics and Cell Biology， Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China；
2.Department of Clinical Laboratory， Affi liated Hospital of North Sichuan Medical College；
3. Key Laboratory of Fertility Preservation and Maintenance of Ministry of Education， Ningxia Medical University

Jiao Haiyan， E-mail: hyjiao1602@hotmail.com

Objective To study the effect of human 8-hydroxyguanine deoxyribonucleic acid glycosidase （hOGG1）SNP rs1052133 and sperm DNA integrity on primary male infertility. Methods Based on case-control and case-only study design， polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms （PCR-RFLP） was used to measure the genotypes of rs1052133 among 332 primary male infertility patients and 329 controls. Sperm chromatin depression （SCD）test was used for the examination of sperm DNA integrity. The correlation between sperm DFI and sperm parameters as well as the effect of different rs1052133 genotypes to the genetic susceptibility of male infertility and DFI were analyzed. Results The DFI of primary male infertility was higher than that of fertile man， and DFI negatively correlated with the ratioof forward motile sperm and the ration of non-forward motile sperm（r = -0.35 and -0.13， P＜0.05）， but positively correlated with immotile sperm （ r =0.24， P＜0.05） . The risk of rs1052133 CC genotype carriers were 1.93 fold higher than that of rs1052133 GG genotype. What’s more， there were no interaction effect between male infertility and cigarette smoking and alcohol consumption as well as no signifi cant difference in sperm DFI among these three genotypes. Conclusion The sperm DNA integrity in male infertility patients were lower than that of fertile men. Sperm DNA damage which signifi cant negative correlated with sperm quality was a cause of primary male infertility. Although the CC genotype of hOGG1 rs1052133 was associated with an increased risk of male infertility， it may be not associated with sperm DNA integrity.

human 8-hydroxyguanine deoxyribonucleic acid glycosidase； polymorphism， Single nucleotide；infertility， male

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.09.004

R 698.2

△共同第一作者

資助: 寧夏自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ NZ14070）

**通訊作者， E-mail: hyjiao1602@hotmail.com