周婧　王洪蘭　馬宏躍　閆文麗　龔艷　錢琎　段金廒　吳啟南

摘 要 研究了除草劑芐嘧磺隆皮膚接觸污染對(duì)中華大蟾蜍分泌蟾酥化學(xué)品質(zhì)的影響。蟾酥樣品經(jīng)甲醇提取，以乙腈-1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，液相色譜（反相C18柱）分離＼， 串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析檢測(cè)。質(zhì)譜條件為：MRM模式，脫溶劑溫度500℃，碰撞電壓30 eV，錐孔電壓為30 V。結(jié)果表明，建立的LC-MS/MS測(cè)定方法對(duì)6種蟾蜍甾烯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢出限為0.42～4.86 ng/mL，相關(guān)系數(shù)R2=0.9953～0.9992，日內(nèi)和日間RSD為3.8%～6.8%和4.0%～8.8%；加樣回收率為96.9%～109.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%～8.1%。應(yīng)用此方法檢測(cè)了36種蟾蜍甾烯化合物，有20余種化合物自身質(zhì)譜積分面積在芐嘧磺隆污染前后發(fā)生改變，芐嘧磺隆皮膚接觸污染可以改變蟾蜍耳后腺蟾蜍毒素的表達(dá)模式。本方法可應(yīng)用于蟾蜍甾烯類物質(zhì)檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 中藥資源學(xué)； 蟾蜍； 芐嘧磺?。?蟾酥

1 引 言

蟾酥為中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider耳后腺的干燥分泌物。以往研究顯示，蟾酥化學(xué)質(zhì)量差異較大[1，2]，不同產(chǎn)地商品中蟾蜍甾烯類成分含量相差數(shù)倍至數(shù)十倍。其原因除了遺傳因素外，環(huán)境影響尤為重要。據(jù)調(diào)查，中藥材蟾酥主要來自于野生蟾蜍，蟾蜍皮膚具有通透性，對(duì)環(huán)境重金屬、農(nóng)藥、生活（工業(yè)）污水敏感[3]，是環(huán)境科學(xué)研究的前哨物種。污染物能在蟾蜍體內(nèi)蓄積和放大，但是污染物對(duì)蟾蜍耳后腺分泌物形成的影響研究甚少。

蟾酥主要含有強(qiáng)心苷類蟾蜍甾烯化合物，其含量測(cè)定方法大體可分為有LC-UV和LC-MS兩類。MS在蟾蜍甾烯定性鑒別和定量靈敏度方面均顯著優(yōu)于UV方法。已有學(xué)者采用Q-TOF和LTQ-Orbitrap對(duì)多種蟾蜍甾烯的質(zhì)譜二級(jí)裂解模式進(jìn)行特征和含量分析[3～10]。在此基礎(chǔ)上，本研究采用四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)對(duì)蟾酥中36種蟾蜍甾烯進(jìn)行檢測(cè)，以質(zhì)譜積分面積表示每種蟾蜍甾烯化合物在不同樣本組間的相對(duì)含量（化合物自身比較），并結(jié)合數(shù)學(xué)模式識(shí)別方法，評(píng)估芐嘧磺隆污染前后蟾蜍分泌蟾酥化學(xué)性質(zhì)的變化。2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與材料

Waters Xevo-TQ 三重四極桿質(zhì)譜儀， 配備Acquity UPLC 系統(tǒng)（包括四元泵溶劑系統(tǒng)、在線脫氣機(jī)和自動(dòng)進(jìn)樣器）， 同時(shí)配有Waters Masslynx V4.1數(shù)據(jù)工作站 （美國Waters 公司）； 低溫超高速離心機(jī)（美國Thermo公司）；離心濃縮儀、冷凍干燥儀（Labconco公司）；EPED超純水系統(tǒng)（南京易普達(dá)易科技發(fā)展有限公司）；電子分析天平（上海精密儀器廠）； 蟾蜍甾烯標(biāo)準(zhǔn)品Cinobufotalin，Resibufagenin，Gamabufotalin，Hellebrigenin，Cinobufagin 和Bufotalin按文獻(xiàn)[1]報(bào)道方法分離制備，高效液相色譜鑒定純度大于95%；芐嘧磺隆（丁貝生物公司）。中華大蟾蜍（捕于南京周邊）。

2.2 芐嘧磺隆污染蟾蜍的分組與取樣

中華大蟾蜍30只， 產(chǎn)地為江蘇省，均分成3組，組間個(gè)體無顯著差異。配制芐嘧磺隆低劑量組（0.15 g/L），高劑量組（0.3 g/L）及正常組（0 g/L）。中華大蟾蜍飼養(yǎng)在含或不含芐嘧磺隆的水溶液中。用分析天平稱取芐嘧磺隆0.15和0.30 g，加到1 L盛有隔夜自來水的燒杯中，攪拌，使之充分溶解。待蟾蜍取食完畢后，將上述配好的藥液倒入蟾蜍培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2天后，倒掉培養(yǎng)箱中原液，把培養(yǎng)箱沖洗干凈，給蟾蜍喂食，待取食完畢后，加入藥液，如此反復(fù)，培養(yǎng)半個(gè)月。抓取蟾蜍，稱體重。用包裹膠布的鑷子擠壓蟾蜍耳后腺，使蟾酥噴濺到載玻片上，將鮮酥刮至EP管中，冷凍干燥，記錄凍干前后蟾酥的重量。

2.3 供試品溶液的制備

將干燥后的蟾酥樣本于研缽中研磨成粉末（未過篩），每個(gè)樣本準(zhǔn)確稱取10 mg，置于玻璃試管中，分別準(zhǔn)確加入5 mL甲醇，保鮮膜封口，超聲提取30 min，冷卻后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.4 色譜/質(zhì)譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）； 柱溫35.0℃；流速0.4 mL/min； 進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫程序： 0～2 min， 20%～30% B； 2～6 min， 30%～35% B； 6～9 min， 35%～60% B； 9～10 min， 60%～95% B； 10～11 min， 95% B； 11～11.20 min： 95%～20% B。

離子源為電噴霧離子源（ESI），正離子模式檢測(cè)；質(zhì)量掃描范圍為 MS1：20～1974 Da，MS2：2～2048 Da；掃描速率為 M1：100～2000 amu/s，M2：100～10000 amu/s；毛細(xì)管電壓為3.00 kV；錐孔電壓為30.00 V；離子源溫度為150℃；脫溶劑氣體流速為998 L/h；脫溶劑溫度500℃。參照文獻(xiàn)[8～15]總結(jié)蟾蜍甾烯化合物的分子離子和子離子，經(jīng)UPLC-MS/MS預(yù)測(cè)，選取36種化合物（表1），其響應(yīng)較強(qiáng)、干擾較小的兩對(duì)子離子可用于定性分析，目標(biāo)化合物檢測(cè)離子對(duì)碰撞電壓（CE）統(tǒng)一設(shè)置為30 eV，可以滿足蟾酥生藥中蟾蜍甾烯的測(cè)定。

2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Waters公司的MarkerLynx XS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的組間比較，用偏最小方差判別分析（PLS-DA）模型對(duì)正常對(duì)照組和污染組進(jìn)行模式識(shí)別，利用有監(jiān)督的OPLS-DA模型排除與樣品分類無關(guān)的信息，得到變量權(quán)重值（Variable important in projection，VIP）。標(biāo)記的為VIP>1的變量，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中p[1]絕對(duì)值越大，對(duì)組間差異的貢獻(xiàn)度越大；p（corr）絕對(duì)值越大，分析結(jié)果的置信度越高。同時(shí)篩選含量差異為1.5倍以上的甾體物質(zhì)為組間差異標(biāo)志物。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。3 結(jié)果與討論endprint

3.1 蟾蜍甾烯類化合物的質(zhì)譜檢測(cè)

采用多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM）對(duì)蟾酥中蟾蜍甾烯水平進(jìn)行測(cè)定。蟾蜍甾烯在陽離子模式下的質(zhì)譜信號(hào)相應(yīng)優(yōu)于陰離子模式?；谖墨I(xiàn)報(bào)道[3～7]和本研究組研究確證，共收集了30余種蟾蜍甾烯類化合物的離子對(duì)信息用于MRM模式檢測(cè)（表1）。蟾蜍甾烯類化合物具有相同的6-元內(nèi)酯環(huán)甾體母核，母核上有羥基、醛基、環(huán)氧基、乙?；然鶊F(tuán)取代，在二級(jí)質(zhì)譜碎裂時(shí)產(chǎn)生有規(guī)律性的裂解特征。圖1是UPLC-Q-TOF測(cè)定蟾酥總離子流圖，圖2為蟾酥中含量較高3種質(zhì)控成分質(zhì)譜二級(jí)碎裂圖譜。如Resibufogenin，[M+H]+ 385， [M+H-H2O]+ 367， [M+H-2H2O]+ 349，[M+H-2H2O-C5H4O2]+ 253；Cinobufagin，[M+H]+ 443，[M+H-CH2CO]+ 401，[M+H-HOAc]+ 383，[M+H-HOAc-H2O]+ 365，[M+H-HOAc-2H2O]+ 347。3種蟾蜍甾烯MS/MS圖均顯示，母離子脫去H2O （18 Da）和CO （28 Da） 是一種顯著的裂解特征；當(dāng)蟾蜍甾烯存在乙酰基取代時(shí)，母離子可以脫去HOAC （60 Da） 或C5H4O2。使用不同的離子對(duì)信息（母離子/子離子）可以區(qū)分蟾蜍甾烯化合物；對(duì)于具有相同離子對(duì)信息的物質(zhì)，根據(jù)其色譜保留時(shí)間不同，進(jìn)一步區(qū)分。圖3為蟾酥中代表性化合物的離子流提取色譜圖。

3.2 蟾蜍甾烯類化合物測(cè)定方法學(xué)考察

配制不同濃度的混標(biāo)物的甲醇溶液（16， 80， 400， 2000和10000 ng/mL），以峰面積為縱坐標(biāo)（y），標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表2可知，所有測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)化合物在測(cè)試濃度內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（R2=0.9953～0.9992）。按信噪比（S/N）為3計(jì)算檢出限（LOD）為0.42～4.86 ng/mL，按S/N=10計(jì)算定量限（LOQ）為1.41～16.20 ng/mL。對(duì)于日內(nèi)精密度考察，

將混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（2000 ng/mL）連續(xù)進(jìn)樣6次分析，以峰面積計(jì)算RSD為3.8%～6.8%；3天連續(xù)測(cè)定的日間精密度RSD為4.0%～8.8%，表明儀器測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。進(jìn)一步將蟾酥樣品溶液于4℃條件下存放0， 2， 4， 8， 12和24 h，測(cè)定蟾酥中6種蟾蜍甾烯的含量標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.4%～8.4%，說明待測(cè)試的蟾酥樣品溶液在4℃存放條件下質(zhì)量穩(wěn)定。對(duì)于加樣回收率測(cè)試，準(zhǔn)確稱取已知含量的蟾酥粉末2 mg，加入1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度2000 ng/mL），1 mL甲醇，按2.3節(jié)制備供試品溶液測(cè)定，計(jì)算得6種標(biāo)準(zhǔn)甾烯化合物的加標(biāo)回收率在96.9%～109.6%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在2.0%～8.1%之間。

3.3 不同濃度芐嘧磺隆污染對(duì)中華大蟾蜍分泌蟾酥的化學(xué)質(zhì)量的影響

在上述色譜-質(zhì)譜條件下，蟾蜍甾烯通過質(zhì)譜響應(yīng)的積分面積進(jìn)行相對(duì)定量（表3）。與正常組相比較，芐嘧磺隆污染組的蟾蜍分泌蟾酥的化學(xué)質(zhì)量明顯不同，芐嘧磺隆低劑量組中，7種游離型蟾蜍甾烯、2種結(jié)合型蟾蜍甾烯水平發(fā)生1.5倍上調(diào)，6種游離型蟾蜍甾烯、3種結(jié)合型蟾蜍甾烯的水平發(fā)生1.5倍下調(diào)。在芐嘧磺隆高劑量組，9種游離型蟾蜍甾烯、2種結(jié)合型蟾蜍甾烯水平發(fā)生1.5倍上調(diào)，3種游離型蟾蜍甾烯、4種結(jié)合型蟾蜍甾烯的水平發(fā)生1.5倍下調(diào)。

將上述不同組別的蟾蜍甾烯的含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入MassLynx V4.1 software （Waters Corp.， Milford， USA）軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)的主成分分析（PCA）、偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）。由于蟾蜍耳后腺分泌的蟾酥的化學(xué)質(zhì)量存在較大的組內(nèi)差別，采用無監(jiān)督的PCA方式不能對(duì)正常組蟾酥和芐嘧磺隆污染組蟾酥進(jìn)行組間的分離。進(jìn)一步采用有監(jiān)督的PLS-DA統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行了組間的區(qū)分（圖4）。其中變量權(quán)重值（Variable important in projection，VIP）>1的變量，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中p[1]絕對(duì)值越大，對(duì)組間差異的貢獻(xiàn)度越大；p（corr）絕對(duì)值越大，分析結(jié)果的置信度越高，同時(shí)變量指標(biāo)平均含量差異發(fā)生1.5倍以上改變的甾體物質(zhì)為組間差異標(biāo)志物，總計(jì)16種差異標(biāo)志物?？梢?，芐嘧磺隆污染會(huì)使蟾蜍毒素的表達(dá)模式發(fā)生改變。

4 結(jié) 論

蟾蜍耳后腺的分泌物是蟾蜍受到外界刺激，合成并分泌的具有自我保護(hù)作用的毒性物質(zhì)。作為常用抗腫瘤中藥，其化學(xué)質(zhì)量波動(dòng)常影響臨床用藥的有效性與安全性。采用建立的蟾蜍甾烯質(zhì)譜檢測(cè)方法對(duì)不同劑量除草劑芐嘧磺隆污染蟾蜍的蟾酥質(zhì)量評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，正常組和芐嘧磺隆組中大部分甾烯類物質(zhì)可以被定性檢測(cè)和相對(duì)定量分析，芐嘧磺隆污染組中多種蟾蜍甾烯表達(dá)模式出現(xiàn)明顯改變，進(jìn)一步加大了蟾酥的質(zhì)量不穩(wěn)定性，增加用藥風(fēng)險(xiǎn)。雖然芐嘧磺隆污染影響蟾蜍甾烯表達(dá)的原因尚不清楚，推測(cè)芐嘧磺隆可能抑制或刺激了蟾蜍耳后腺中合成蟾蜍甾烯的相關(guān)酶系，使得蟾蜍甾烯生物合成受到影響?？傊?，本文所建立的四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定蟾蜍甾烯類成分的方法具有靈敏、快速、穩(wěn)定的特點(diǎn)，能有效滿足不同條件下蟾蜍耳后腺分泌物中蟾蜍甾烯成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)要求。

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