李堆淑

摘要： 從陜西省商洛市商州區(qū)不同植被下采取土樣，分離出65株生防放線菌，其中從苜蓿中分離的MX3菌株對(duì)黃芩根腐病菌的生防效果最強(qiáng)。采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)MX3菌株代謝產(chǎn)物產(chǎn)淀粉酶活性進(jìn)行測(cè)定，優(yōu)化發(fā)酵條件。結(jié)果表明：?jiǎn)我蛩卦囼?yàn)得出MX3菌株的最佳碳源、氮源分別為玉米粉、酵母膏，最適裝液量為125 mL，最適溫度為28 ℃，最適初始pH值為6 0，最適搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min，最適發(fā)酵時(shí)間為6 5 d。由正交試驗(yàn)得到MX3菌株的最佳發(fā)酵條件組合為裝液量125 mL、pH值7 0、發(fā)酵時(shí)間5 5 d、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。

關(guān)鍵詞： 生防放線菌；淀粉酶；發(fā)酵液；正交試驗(yàn)；發(fā)酵條件；優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939 97 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）08-0376-03

生防放線菌，尤其是鏈霉菌屬是藥物研究的重要微生物資源，也是微生物生長(zhǎng)發(fā)育和代謝產(chǎn)物研究的良好材料 [1-2]。放線菌的鏈霉菌屬及其相關(guān)類(lèi)群也用在植物病害的生物防治方面，生防放線菌在寄主體外通過(guò)各種生物作用降低病原菌侵染 [3-4]。Kemira將從泥煤中分離的灰綠鏈霉菌作為制劑，主要用于防治鐮刀菌、腐霉菌、疫霉菌、絲核菌等土傳病原菌 [5]。我國(guó)研制的細(xì)黃鏈霉菌“5406”不但能夠防治多種植物病原菌的生長(zhǎng)，還對(duì)植物生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用 [6]，也可以在寄主植物組織內(nèi)誘發(fā)其產(chǎn)生抗性。淀粉酶對(duì)淀粉的水解作用是生物體利用淀粉進(jìn)行新陳代謝的初級(jí)反應(yīng)，也是工業(yè)上產(chǎn)量最大的酶制劑品種 [7]。淀粉酶分布廣泛，遍及微生物及高等植物，其種類(lèi)繁多，特點(diǎn)各異，用途較廣，主要應(yīng)用于發(fā)酵、果汁、食品加工、醫(yī)藥、造紙、印染、洗滌劑、工業(yè)副產(chǎn)品、青貯飼料及廢料的處理等多種領(lǐng)域 [8-10]。目前對(duì)細(xì)菌產(chǎn)淀粉酶的研究較多，其中研究芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶 [11-14]、放線菌產(chǎn)淀粉酶的較少 [15]。生防放線菌的研究主要集中于抑菌性 [16-17]，但對(duì)高抗菌、高產(chǎn)淀粉酶的放線菌研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究從陜西省商洛市商州區(qū)苜蓿地采集土樣，通過(guò)選取培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件等因素進(jìn)行試驗(yàn)，以期獲得生防放線菌代謝產(chǎn)物產(chǎn)淀粉酶的最優(yōu)發(fā)酵條件，不僅為研究生防放線菌在不同條件下的高抗菌性作了鋪墊，而且為開(kāi)發(fā)新菌株用于淀粉酶工業(yè)的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1 1 材料

1 1 1 供試材料 從陜西省商洛市商州區(qū)不同植被模式下采集土樣，分離出65株生防放線菌；從黃芩根部分離的黃芩根腐病菌。[LL]

1 1 2 培養(yǎng)基 高氏1號(hào)培養(yǎng)基（改良）：每300 mL培養(yǎng)基中滴加1 mL 50 μg/mL K2Cr2O7；馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）；種子培養(yǎng)基；淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基（150 mL規(guī)格的三角瓶中裝液量為125 mL）。

[BT2++0 2mm]1 2 試驗(yàn)方法

1 2 1 粗酶液淀粉酶活性測(cè)定 采用3，5-二硝基水楊酸顯色法測(cè)定酶活性 [18]。在60 ℃、pH值=6 0的條件下，1 h內(nèi)2%的可溶性淀粉溶液中釋放出1 mg葡萄糖的酶量定義為1個(gè)酶活性單位。

1 2 2 單因素試驗(yàn)對(duì)MX3菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化 活化斜面保存的MX3菌株，接種到改良的高氏1號(hào)培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，以4%的接種量接種培養(yǎng)5 d的種子培養(yǎng)液；再將種子培養(yǎng)液以10%的接種量接種于發(fā)酵液中，在28 ℃、130 r/min條件下培養(yǎng)5 d后，測(cè)定MX3菌株發(fā)酵液的淀粉酶活性。

主要單因素的設(shè)置為：（1）碳源：淀粉、玉米粉、牛肉膏、碳酸鈉、葡萄糖；（2）氮源：黃豆餅粉、硝酸鈉、硫酸銨、蛋白胨、酵母膏；（3）裝液量：50、75、100、125、150 mL；（4）溫度：25、28、30、35、37 ℃；（5）初始pH值：6 0、7 0、8 0、9 0、10 0；（6）發(fā)酵時(shí)間：5 0、5 5、6 0、6 5、7 0 d；（7）搖床轉(zhuǎn)速：80、100、130、150、200 r/min。

1 2 3 正交試驗(yàn)對(duì)MX3菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)所得的各個(gè)最佳發(fā)酵條件進(jìn)行正交試驗(yàn)，詳見(jiàn)表1設(shè)計(jì)的因素水平和表2組合的L9（34）發(fā)酵條件，發(fā)酵培養(yǎng)各組合的MX3菌株發(fā)酵液，測(cè)定其發(fā)酵液的淀粉酶活性。

2 結(jié)果與分析

2 1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2 1 1 確定MX3菌株發(fā)酵液的最佳碳源 采用改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基，用淀粉、玉米粉、牛肉膏、碳酸鈉、葡萄糖5種碳源，測(cè)定MX3菌株發(fā)酵液的淀粉酶活性，從中篩選最佳碳源。如表3所示，酶活性排序?yàn)橛衩追?可溶性淀粉>碳酸鈉>牛肉膏>葡萄糖，可見(jiàn)玉米粉作為碳源時(shí)，MX3菌株發(fā)酵液的淀粉酶活性最大，為17 45 U/mL，因此玉米粉為最佳碳源。

2 1 2 確定MX3菌株發(fā)酵液的最佳氮源 改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基以玉米粉為碳源，對(duì)其進(jìn)行最佳氮源選擇，采用黃豆餅粉、酵母膏、硝酸鈉、蛋白胨、硫酸銨5種氮源，測(cè)定MX3菌株發(fā)酵液的淀粉酶活性。如表3所示，酶活性排序?yàn)榻湍父?硝酸鈉>黃豆餅粉>蛋白胨>硫酸銨，可見(jiàn)以酵母膏作為氮源時(shí)，MX3菌株發(fā)酵液的淀粉酶活性最大，為43 05 U/mL，因此認(rèn)為酵母膏為最佳氮源。

2 1 3 確定MX3菌株發(fā)酵液的最佳裝液量 改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基分別以玉米粉為碳源、酵母膏為氮源，在150 mL的三角瓶中分別裝入發(fā)酵培養(yǎng)基50、75、100、125、150 mL，接種MX3菌株。如表3所示，當(dāng)裝液量增加到125 mL時(shí)，發(fā)酵液的淀粉酶活性達(dá)到最大值，為11 51 U/mL；發(fā)酵液量繼續(xù)增加，其淀粉酶活性下降，可見(jiàn)MX3菌株發(fā)酵液最佳搖瓶裝液量為125 mL（三角瓶規(guī)格150 mL）。

2 1 4 確定MX3菌株的最佳培養(yǎng)溫度 改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基分別以玉米粉為碳源、酵母膏為氮源，裝液量為125 mL（三角瓶規(guī)格150 mL），溫度分別設(shè)為25、28、30、35、37 ℃，培養(yǎng) 5 d 后測(cè)定MX3菌株各發(fā)酵液的淀粉酶活性。如表3所示，溫度對(duì)發(fā)酵液中淀粉酶活性有一定的影響，溫度在25～28 ℃，隨著溫度的升高，發(fā)酵液的淀粉酶活性逐漸增大，在 28 ℃ 時(shí)，其淀粉酶活性達(dá)到最大值，為4 49 U/mL；當(dāng)溫度升高到30、35、37 ℃時(shí)，發(fā)酵液的淀粉酶活性逐漸減小，說(shuō)明溫度偏高不利于MX3菌株的發(fā)酵培養(yǎng)，因此認(rèn)為28 ℃為MX3菌株的最佳培養(yǎng)溫度。endprint

2 1 5 確定MX3菌株發(fā)酵液初始pH值 改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基分別以玉米粉為碳源、酵母膏為氮源，裝液量為125 mL（三角瓶規(guī)格150 mL），于28 ℃培養(yǎng)。將MX3菌株發(fā)酵液初始pH值分別調(diào)至6 0、7 0、8 0、9 0、10 0，然后分別培養(yǎng) 5 d，測(cè)定MX3菌株發(fā)酵液的淀粉酶活性。如表3所示，當(dāng)發(fā)酵液初始pH值為6 0時(shí)，其淀粉酶活性最大，為6 26 U/mL；隨著發(fā)酵液的初始pH值增加，MX3菌株發(fā)酵液代謝產(chǎn)物淀粉酶活性逐漸減小。

2 1 6 確定MX3菌株的最佳發(fā)酵時(shí)間 改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基分別以玉米粉為碳源、酵母膏為氮源，裝液量為125 mL（三角瓶規(guī)格150 mL），于28 ℃培養(yǎng)，pH值設(shè)為6 0，篩選MX3菌株最佳發(fā)酵時(shí)間，每隔12 h取樣。如表3所示，MX3菌株發(fā)酵液培養(yǎng)5 0～6 5 d時(shí)，發(fā)酵液的淀粉酶活性不斷增大，在6 5 d時(shí)其淀粉酶活性最大，為10 80 U/mL；繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，其淀粉酶活性不斷降低，培養(yǎng)7 0 d時(shí)，其淀粉酶活性已經(jīng)下降為0 92 U/mL（表中未列），因此最佳的發(fā)酵時(shí)間為6 5 d。

2 1 7 確定MX3菌株發(fā)酵培養(yǎng)的最佳搖床轉(zhuǎn)速 改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基分別以玉米粉為碳源、酵母膏為氮源，裝液量為125 mL（三角瓶規(guī)格150 mL），于28 ℃培養(yǎng)，pH值設(shè)為6 0，發(fā)酵時(shí)間為6 5 d，MX3菌株發(fā)酵液的搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)為0、100、130、150、200 r/min，分別測(cè)定其發(fā)酵液的淀粉酶活性。如表3所示，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加，其發(fā)酵液的淀粉酶活性逐漸增大，轉(zhuǎn)速為130 r/min 時(shí)其發(fā)酵液的淀粉酶活性最大，為6 60 U/mL；隨后，再增加發(fā)酵液的搖床轉(zhuǎn)速，其發(fā)酵液的淀粉酶活性緩慢下降。

2 2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)4因素3水平的L9（34） 正交表設(shè)計(jì)9種不同的發(fā)酵培養(yǎng)條件，測(cè)定MX3菌株發(fā)酵液的淀粉酶活性，優(yōu)化發(fā)酵條件。如表4所示，各因素的影響力排序?yàn)镃>A>B>D，最優(yōu)組合為組合A2B2C1D3，即裝液量125 mL、pH值為7 0、發(fā)酵時(shí)間5 5 d、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min時(shí)，MX3菌株發(fā)酵液的淀粉酶活性最大，為35 71 U/mL，比改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基分別以玉米粉為碳源、酵母膏為氮源時(shí)，以及單因素（裝液量、pH值、培養(yǎng)時(shí)間、搖床轉(zhuǎn)速）試驗(yàn)的發(fā)酵液淀粉酶活性都高（表4）。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果可知，因素D（搖床轉(zhuǎn)速）對(duì)MX3菌株發(fā)酵液的淀粉酶活性的影響最小，經(jīng)正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析，因素D的均差平方和太小，與其他3個(gè)因素的均差平方和相差太大，因此可以將其合并到誤差效應(yīng)中，用合并后的誤差效應(yīng)做F檢驗(yàn)，自由度大，靈敏度更大。F0 01（2，2）=99 0，F(xiàn)0 05（2，2）=19 0，F(xiàn)0 10（2，2）=9 0，由表5可見(jiàn)，F(xiàn)A< F0 10，F(xiàn)B< F0 10，F(xiàn)0 10

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)研究生防放線菌MX3菌株代謝產(chǎn)物產(chǎn)淀粉酶的活性，通過(guò)單因素試驗(yàn)得出MX3菌株發(fā)酵液最佳單因素發(fā)酵條件：碳源為玉米粉、氮源為酵母膏、裝液量為125 mL、溫度為28 ℃、pH值為6 0、發(fā)酵時(shí)間為6 5 d、搖床轉(zhuǎn)速 130 r/min。根據(jù)選定的最佳碳源、氮源的培養(yǎng)基配方和4因素3水平的L9（34）正交試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵條件組合，得出各因素的影響力排序?yàn)镃>A>B>D，各因素的最優(yōu)組合為A2B2C1D3，即生防放線菌MX3菌株發(fā)酵液的裝液量為 125 mL、pH值為7 0、發(fā)酵時(shí)間為5 5 d、搖床轉(zhuǎn)速為 200 r/min 時(shí)，MX3菌株發(fā)酵液的代謝產(chǎn)物產(chǎn)淀粉酶活性最大，為35 71 U/mL。經(jīng)正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析可知，發(fā)酵時(shí)間（C）對(duì)MX3菌株發(fā)酵液的淀粉酶活性有顯著影響，發(fā)酵液、pH值、搖床轉(zhuǎn)速對(duì)MX3菌株發(fā)酵液的淀粉酶活性影響都不顯著。通過(guò)本試驗(yàn)優(yōu)化生防放線菌MX3菌株最佳產(chǎn)淀粉酶活性的發(fā)酵條件。劉雪珠等通過(guò)紫外線、超聲波、熱等多種物理誘變選育的產(chǎn)淀粉酶放線菌A24，經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)其酶活性為 353 67 U/mL [19]，比本研究分離出的生防放線菌MX3菌株的淀粉酶活性高得多，主要是由于本研究的生防放線菌MX3菌株并未經(jīng)過(guò)各種物理?xiàng)l件的誘導(dǎo)處理，其方法還須進(jìn)一步研究。本研究分離出產(chǎn)淀粉酶生防放線菌MX3菌株，初步的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定表明，該菌株應(yīng)用前景較好，一方面放線菌MX3菌株既能被制成各種制劑應(yīng)用于植物病害防治，同時(shí)不污染環(huán)境；另一方面能通過(guò)改良該菌株的遺傳與基因工程，使其有利于淀粉酶工業(yè)發(fā)展。

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