楊劍，李斌，董小麗，楊娜，張蓓（.中國石油長慶油田分公司第一采油廠，陜西延安　76000；.中國石油長慶油田分公司技術(shù)監(jiān)測中心，陜西西安　7008；.中國石油長慶油田分公司生產(chǎn)運行處，陜西西安　7008）

安塞油田驅(qū)油微生物多樣性研究及篩選

楊劍1，李斌1，董小麗2，楊娜3，張蓓1
（1.中國石油長慶油田分公司第一采油廠，陜西延安716000；2.中國石油長慶油田分公司技術(shù)監(jiān)測中心，陜西西安710018；3.中國石油長慶油田分公司生產(chǎn)運行處，陜西西安710018）

利用微生物及其代謝產(chǎn)物作用于原油提高采收率，首先必須了解油藏本源微生物種類，進(jìn)行油藏微生物菌種多樣性分析。提取安塞油田油水樣品，進(jìn)行菌種分離培養(yǎng)、提取和純化DNA，設(shè)計適合的引物進(jìn)行目的基因PCR擴(kuò)增、高通量測序，對序列結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，得到安塞油田驅(qū)油微生物多樣性研究結(jié)果。分析認(rèn)為安塞油田本源微生物種類豐富，主要是芽孢桿菌綱、梭菌綱、α-變形菌綱及γ-變形菌崗等細(xì)菌，又以芽孢桿菌崗屬占優(yōu)勢分布。在此基礎(chǔ)上篩選出一株產(chǎn)生物表面活性劑微生物，發(fā)酵液稀釋30倍后與原油的界面張力僅為1.727 6 mN/m，具有較強(qiáng)的降低油水界面張力的能力，篩選出一株產(chǎn)生物聚合物微生物，發(fā)酵液中生物聚合物含量高達(dá)800 mg/L，具有較強(qiáng)的產(chǎn)生物聚合物能力。最終由這兩種微生物菌種構(gòu)建微生物驅(qū)油體系。

低滲透油藏；驅(qū)油微生物；分子生物學(xué)；生物表面活性劑；生物聚合物

油藏微生物菌種多樣性分析目前主要采用分子生物學(xué)DNA標(biāo)記方法［1］。多樣性檢測的分子標(biāo)記主要包括：限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、隨即擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、DNA擴(kuò)增指紋分析（DAF）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）、16SrRNA基因序列分析等，目前應(yīng)用較為廣泛的是基于微生物16SrRNA特異性基因序列的標(biāo)記技術(shù)。16SrRNA為原核生物核糖體中一種核糖體RNA，大小約1.5 kb左右。其種類少、含量大（約占細(xì)菌RNA含量的80％），分子大小適中，存在于所有的生物中，特別是其進(jìn)化具有良好的時鐘性質(zhì)，在結(jié)構(gòu)和功能上具有高度的保守性，素有“細(xì)菌化石”之稱。16SrRNA既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術(shù)來較容易地得到其序列，故被微生物學(xué)家及分類學(xué)家所接受［2］。

通過從環(huán)境樣品中提取和純化DNA，設(shè)計適合的引物進(jìn)行目的基因PCR擴(kuò)增、測序，對序列結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，即可得到相應(yīng)的多樣性分析結(jié)果。該結(jié)果對目標(biāo)油藏微生物種質(zhì)資源調(diào)查提供基礎(chǔ)資料，對油藏的后期開發(fā)中有效驅(qū)油菌株的構(gòu)建有指導(dǎo)作用。

1　試驗材料及儀器

1.1試驗材料

E.Z.N.A Soil DNA試劑盒（OMEGA公司）、瓊脂糖凝膠、AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）、TransStart FastPfu DNA Polymerase（聚合酶）、TransGen AP221-02、Tris-HCl緩 沖 液 、EmPCR（Roche emPCRAmp-Lib_L Kit公司）。

1.2實驗儀器

ABI GeneAmpR9700型PCR儀、QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）、Roche Genome Sequencer FLX+（測序系統(tǒng)）、mothur軟件、JYW-200A 表/界面張力儀、SVT-20旋轉(zhuǎn)滴界面張力儀（德國）、恒溫箱。

2　試驗方法及結(jié)果

2.1驅(qū)油微生物多樣性研究

2.1.1基因組DNA提取采集安塞油田長6油藏油樣6個，用采樣容器分別取水樣1 L，油樣1 L（油水分離，經(jīng)濾紙除雜），封口并記錄井號，做好試樣標(biāo)記，放置于4℃的條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

對采樣的6個樣品使用OMEGA公司E.Z.N.A Soil DNA試劑盒抽提基因組DNA，采用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。

2.1.2引物設(shè)計按指定測序區(qū)域，合成帶有“5'454 A、B接頭-特異引物3'”的融合引物，A為測序端，需加標(biāo)簽，B端引物可共用。為保證后續(xù)數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性及可靠性，需滿足兩個條件：（1）盡可能使用低循環(huán)數(shù)擴(kuò)增；（2）保證每個樣品擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)一致。隨機(jī)選取具有代表性的樣品進(jìn)行預(yù)實驗，確保在最低循環(huán)數(shù)中絕大多數(shù)樣品能夠擴(kuò)增出濃度合適的產(chǎn)物［3］。

表1引物序列

圖1　熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.3PCR擴(kuò)增每個樣品3個重復(fù)，將同一樣品混合后用2％瓊脂糖凝膠電泳，使用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫；2％瓊脂糖電泳檢測，2 μL上樣檢測［4］。

2.1.4熒光定量將已構(gòu)建好的PCR產(chǎn)物文庫參照電泳初步定量結(jié)果，使用 Promega公司的QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測［5］，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1）。

6個樣品待測PCR產(chǎn)物文庫濃度較高（均高于4 ng/μL），足以滿足下一步測序要求，數(shù)據(jù)（見表2）。

表2　PCR產(chǎn)物文庫定量結(jié)果統(tǒng)計表

2.1.5測序及數(shù)據(jù)分析將每個樣品的測序量比例混合，使用EmPCR產(chǎn)物，使用Roche Genome Sequencer FLX+上機(jī)測序。分析步驟：（1）去除序列末端的接頭序列、后引物序列、多堿基N、polyA/T尾巴及低質(zhì)量序列；（2）去除（1）中所得序列的條形碼標(biāo)簽序列、前引物序列；（3）丟棄長度短于200 bp、模糊堿基數(shù)大于0、序列平均質(zhì)量低于25的序列［6］。

優(yōu)化后樣品平均長度446 bp，數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果（見表3）。

表3　有效序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計

表4 樣品OTU列表（部分）

表4 樣品OTU列表（部分）（續(xù)表）

2.1.6多樣性分析及結(jié)果采用OTU聚類分析方法［7］，將所有測序結(jié)果作為OUT數(shù)，先將相似度均達(dá)到97％以上的1對序列聚為一類，即為1個OUT，名稱為OTU1，再重新比較剩余序列中哪1對相似度均可以達(dá)到97％以上，將其聚為一類，命名為OTU2，如此反復(fù)計算，直至完成所有分析。此次分析應(yīng)用mothur軟件進(jìn)行。

6個樣品共計聚類得到1 050個OTU，各OTU中每個樣品豐度不一，數(shù)據(jù)（見表4）。其中樣品中含量最豐富的是芽孢桿菌綱細(xì)菌，其次是梭菌綱、α-變形菌綱和γ-變形菌綱細(xì)菌；主要菌屬為芽孢桿菌屬、乳酸球菌屬、環(huán)絲菌屬、假黃色單胞菌屬、色鹽桿菌屬等（見表4）。

2.2驅(qū)油微生物篩選

微生物增產(chǎn)和作用于原油非常復(fù)雜，一般有多種生物化學(xué)過程相互作用。微生物在油藏中的作用有：微生物本身聚集或生成生物聚合物堵塞高滲透透層并改變水驅(qū)方向；生成表面活性劑，增加殘余油流動力；產(chǎn)生CO2或甲烷，增加氣體壓力；消化大分子，降低原油黏度等［8］。

2.2.1產(chǎn)生物表面活性劑微生物篩選采用稀釋分離法［9］將油井采出水進(jìn)行梯度稀釋后，取菌液涂平板，將混雜的菌種在瓊脂平板表面上分散，培養(yǎng)獲得單菌落。利用產(chǎn)生物表面活性劑的微生物具有溶血的特性，在血平板上形成透明圈，以此現(xiàn)象初步篩選出產(chǎn)表面活性劑的驅(qū)油菌株DN001、DN005、DN035，溶血圈直徑分別為4.1 mm、3.3 mm和3.5 mm。將三種微生物菌株分別接種到200 mL液體搖瓶培養(yǎng)基中，150 r/min、37℃條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h，用SVT-20旋轉(zhuǎn)滴界面張力儀對安塞油田地層水、培養(yǎng)基、三株微生物稀釋的發(fā)酵液進(jìn)行界面張力測定，數(shù)據(jù)（見表5）。

安塞油田原油與地層水界面張力為11.423 2 mN/m， 30倍稀釋的DN001菌株發(fā)酵液與原油的界面張力為1.727 6 mN/m，說明DN001菌株發(fā)酵液具有較強(qiáng)的降低油水界面張力的能力，產(chǎn)表面活性劑性能最好（見圖2）。

表5　油水界面張力的測定

圖2　DN001菌株發(fā)酵液界面張力測定

采用液相色譜、液質(zhì)分析方法對發(fā)酵液中的代謝產(chǎn)物的種類進(jìn)行鑒定，主要次級代謝產(chǎn)物是鼠李糖脂和脂肽，屬于糖脂類和脂肽類生物表面活性劑（見圖3，圖4）。

2.2.2產(chǎn)生物聚合物微生物篩選采取稀釋分離法獲得微生物單菌落，進(jìn)行菌種純化，初步分離篩選20株微生物，按3％比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖培養(yǎng)基不加瓊脂），150 r/min，37℃搖床培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵液粘度。菌株DN002、DN016、DN022和DN034的發(fā)酵液粘度較高均在15 mPa·s以上，初步選擇這四株菌進(jìn)行后續(xù)試驗。

用安塞油田地層水配制搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，將上述4種微生物菌株3％的比例分別接種到培養(yǎng)基中，模擬油田地層溫度，在45℃，150 r/min的條件下，搖床振蕩培養(yǎng)。每隔8 h測定菌液濃度，繪制生長曲線，測定發(fā)酵液粘度，優(yōu)選出產(chǎn)生生物聚合物的最佳菌株（見圖5，圖6）。

圖5　菌株生長曲線對比

圖6　發(fā)酵液粘度隨時間變

由圖5，圖6可知，菌株DN002培養(yǎng)8 h即進(jìn)入對數(shù)生長期，24 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，而且穩(wěn)定期長達(dá)24 h，產(chǎn)生的菌濃度最高，培養(yǎng)32 h時最大菌濃為6.5×108個/毫升。菌株DN016和DN034的菌濃度也相對較高，但穩(wěn)定期相對較短。4種發(fā)酵液粘度達(dá)到最大值之后，均能穩(wěn)定保持。其中菌株DN002在32 h即可達(dá)到最大粘度值26 mPa·s，32 h～72 h粘度值變化不大。而其它三種微生物的最大粘度值均小于DN002，且在達(dá)到最大粘度值后都有所降低。因此，綜合菌種濃度和發(fā)酵液粘度兩項因素，確定選擇DN002作為用來產(chǎn)生生物聚合物的目的菌。

圖3　DN001發(fā)酵液液相色譜254 nm測定結(jié)果

圖4　DN001發(fā)酵液液質(zhì)鑒定結(jié)果

對DN002菌株接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，置于45℃、150 r/min培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，5 d后對其產(chǎn)生聚合物進(jìn)行分析測定。將培養(yǎng)后的培養(yǎng)液離心（8 000 r/min～9 000 r/min，30 min），用移液管吸取上清液，用5倍體積95％的酒精沉淀生物聚合物，收集生物聚合物并用95％的酒精洗滌，50℃恒溫烘箱中烘干后稱重，經(jīng)檢測生物聚合物含量為800 mg/L。

2.2.3微生物分子生物學(xué)檢測對篩選出來的兩種菌株進(jìn)行分子生物學(xué)16SrRNA檢測。通過PCR擴(kuò)增得到目的基因片段，經(jīng)測序為1 500 bp左右的16SrRNA部分序列，利用GenBank Blast在線比對進(jìn)行序列同源性比較，結(jié)果顯示菌株DN001的16SrRNA序列與多株假單胞菌具有高度同源性，菌株DN002和CYR602與枯草芽孢桿菌有高度同源性。通過Clustal X進(jìn)行聚類分析后，利用MEGA4.1軟件生成系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（見圖7，圖8）。

圖7　DN001菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖8　DN002菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3　結(jié)論

（1）安塞油田本源微生物種類豐富，6個樣品中均檢測到了大量種屬的本源微生物。其中1號樣微生物種類最多，含有4個菌綱6 992種微生物；6號樣微生物種類最少，有11個菌綱4 589種微生物。本源微生物以芽孢桿菌綱占絕對優(yōu)勢，1號樣中芽孢桿菌綱微生物高達(dá)6 985種，3號樣中芽孢桿菌綱微生物最少有3 019種，分別占到了總菌屬的99.9％和61.8％。在兩個樣品的屬種分布中，又以芽孢桿菌屬占優(yōu)勢分布，分別占到了94.22％和31.34％。

（2）對微生物稀釋、分離、純化，篩選出產(chǎn)生物表面活性劑微生物DN001，屬于假單胞菌，發(fā)酵液稀釋30倍與原油的界面張力僅為1.727 6 mN/m，具有較強(qiáng)的降低油水界面張力的能力。微生物DN002屬于枯草芽孢桿菌，具有較強(qiáng)的產(chǎn)生物聚合物能力，發(fā)酵液中生物聚合物含量高達(dá)800 mg/L，且該微生物生長能力較強(qiáng)，培養(yǎng)8 h即進(jìn)入對數(shù)生長期，快速繁殖，24 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，而且穩(wěn)定期長達(dá)24 h，產(chǎn)生的菌濃度最高為6.5× 108個/毫升。

［1］夏北成，Zhou J Z，T ied je J M.分子生物學(xué)方法在微生物形態(tài)中的應(yīng)用［J］.中山大學(xué)學(xué)報，1998，37（2）：97-101.

［2］劉文強(qiáng)，賈玉萍，趙宏坤，等.16SrRNA在細(xì)菌分類鑒定研究中的應(yīng)用［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，27（11）：15-18.

［3］尤超，趙大球，梁乘榜，等.PCR引物設(shè)計方法綜述［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011，14（17）：48-51.

［4］魏鑫麗，魏江春.用于PCR擴(kuò)增的DNA簡易制備法現(xiàn)狀［J］.菌物研究，2003，1（1）：52-54.

［5］劉渠，李涌，陳應(yīng)堅，等.大腸桿菌熒光定量PCR方法和多管發(fā)酵法檢測結(jié)果相關(guān)性研究［A］.張云.2011廣東省預(yù)防醫(yī)學(xué)會學(xué)術(shù)年會資料匯編［C］.廣東省廣州市：廣東省預(yù)防醫(yī)學(xué)會，2011：353-358.

［6］黃勇.基于高通量測序的微生物基因組學(xué)研究［D］.北京：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)院檔案館，2013.

［7］王珊珊，江潔曙，方晶晶，等.25株泛耐藥綠銅假單胞菌耐藥與毒素基因的樣本聚類分析［A］.張云.中華醫(yī)學(xué)會第一屆重癥心臟全國學(xué)術(shù)大會暨第二屆西湖重癥醫(yī)學(xué)論壇、2013年浙江省重癥醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編［C］.浙江省杭州市：浙江省醫(yī)學(xué)會重癥醫(yī)學(xué)分會，2013：524-531.

［8］王小林，王學(xué)剛，馬翠巖，等.微生物驅(qū)油技術(shù)綜述［J］.國外油田工程，2007，23（3）：5-8.

［9］張軼華.稀釋分離法鑒定嗜鰭黃桿菌［J］.鞍山師范學(xué)院學(xué)報，2010，12（2）：43-47.

Flooding microbial diversity research and screening of Ansai oilfield

YANG Jian1，LI Bin1，DONG Xiaoli2，YANG Na3，ZHANG Bei1
（1.Oil Production Plant 1 of PetroChina Changqing Oilfield Company，Yan'an Shanxi 716000，China；2.Technical Testing Center of PetroChina Changqing Oilfield Company，Xi'an Shanxi 710018，China；3.Product Managment Department of PetroChina Changqing Oilfield Company，Xi'an Shanxi 710018，China）

Using microorganisms and their metabolic products to improve recovery of crude oil，firstly understand reservoir source of microbial species，analysis of oil reservoir microbial species diversity.Extracting oil and water samples of Ansai oilfield，separating strains of cultivation，extracting and purificating of DNA，designing a suitable primers for PCR amplification，sequencing high-throughput gene，analysising the sequence result of bioinformatics，ansai oilfield flooding microbial diversity research results of Ansai oilfield are obtained.Ansai oilfield source microorganism is variety，mainly bacillus classes is clostridium，alpha deformation and gamma phylum bacteria such as and belong to the dominant distribution with bacillus hillock.On the basis of the screened strains produce surfactants microorganisms，fermented liquid and interfacial tension of crude oil after 30 times dilution was only 1.727 6 mN/m，hasstrong ability to reduce the oil-water interfacial tension，and screened strains produce polymer microorganisms，biological polymer content in the fermented liquid is as high as 800 mg/L，has the strong ability of producing polymer content.Finally by the two strains build microbial oil displacement system.

low permeability；displacement of microbial；molecular biology；biosurfactant；biopolymers

10.3969/j.issn.1673-5285.2015.01.005

TE357.46

A

1673-5285（2015）01-0016-07

2014－10-10

楊劍，女（1983-），采油工程師，2013年碩士畢業(yè)于中國石油大學(xué)（北京）石油與天然氣專業(yè)，現(xiàn)從事油田提高采收率工作，郵箱：yjian2_cq@petrochina.com.cn。