周彩存

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，“精準(zhǔn)醫(yī)療”已經(jīng)成為了腫瘤診療新進(jìn)展中最為熱門的詞匯之一。在腫瘤臨床診療過程中，特別是肺癌的臨床實(shí)踐中，先明確腫瘤的基因組學(xué)類型，是臨床治療的第一步。諸多研究已經(jīng)證實(shí)，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）突變與ALK融合基因表達(dá)的患者接受相應(yīng)的靶向治療的療效顯著優(yōu)于含鉑雙藥化療[1-3]。因此，國內(nèi)外的臨床指南均推薦肺腺癌患者在接受治療前必需接受基因檢測[4,5]。但是，如果接受基因檢測，患者必需接受有創(chuàng)的組織活檢，患者所受損傷較大。另一方面，靶向藥物通常會在10個月左右產(chǎn)生耐藥[6]，如何提供有效的手段監(jiān)測耐藥，同時提示耐藥機(jī)制便成為非常重要的步驟。

基于如上原因，“液態(tài)活檢”的概念應(yīng)運(yùn)而生，有文獻(xiàn)[7]報道，液態(tài)活檢是指運(yùn)用敏感的血液學(xué)檢測方法在千萬背景血細(xì)胞中檢測并分析潛在的腫瘤細(xì)胞。簡而言之，就是通過血液檢測代替腫瘤組織檢測。隨著各種高敏感度檢測方法的問題，液態(tài)活檢如果按其來源可分為循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell, CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）、小分子RNA（mircoRNA）、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA）等腫瘤。目前臨床常用主要為CTC和ctDNA。

已有較多研究[8-11]探索了CTC和ctDNA在肺癌診療過程中的應(yīng)用前景。其中，CellSearch的CTC檢測在乳腺癌領(lǐng)域已經(jīng)有被CFDA批準(zhǔn)的檢測方法。但是，由于大部分肺癌細(xì)胞遷移入血的過程中容易出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程，從而丟失了表面上皮粘附分子的表達(dá)。而上皮粘附分子又是CellSearch系統(tǒng)主要的捕獲靶標(biāo)，因此，CellSearch在肺癌中的CTC檢測結(jié)果并不盡如人意。因此，國內(nèi)有多種改良技術(shù)，在肺癌領(lǐng)域探索了其他方法檢測CTC的效率。另一方面，ctDNA檢測在國內(nèi)也處于臨床探索的熱點(diǎn)。因此，本文主要對于CTC與ctDNA的檢測方法、臨床應(yīng)用的側(cè)重點(diǎn)、未來的研究方向進(jìn)行綜述，期望能為臨床合理嘗試“液態(tài)活檢”提供依據(jù)。

1 CTCs

1.1 CTCs的前世今生 1869年，澳大利亞一名叫Thomas Ashworth的內(nèi)科醫(yī)生[12]，他通過顯微鏡觀察到一例死于轉(zhuǎn)移瘤患者，其外周血中存在與原發(fā)腫瘤相似的細(xì)胞，這樣的細(xì)胞或許能反映原發(fā)腫瘤的特性，被稱為CTCs。由于檢測手段的限制及細(xì)胞的稀少，直到20世紀(jì)90年代，CTCs的價值才被內(nèi)科醫(yī)生充分認(rèn)識到。1889年英國病理學(xué)家Paget提出了著名的“種子和土壤”假說（seed and soil hypothesis）[13]。該假說強(qiáng)調(diào)腫瘤細(xì)胞和靶組織兩個導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素，認(rèn)為器官微環(huán)境（“土壤”）可影響特定腫瘤細(xì)胞（“種子”）的種植、侵襲、存活、生長，腫瘤轉(zhuǎn)移早期常呈現(xiàn)特異臟器親合性。其中，CTCs 即是該假說中的“種子”，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。此學(xué)說成功地闡釋了癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機(jī)理。臨床研究[14-16]顯示，CTCs在肺癌的輔助診斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測、療效評估及檢測肺癌分子表達(dá)譜中具有重要的臨床意義。

1.2 CTCs的生物學(xué)特征 腫瘤原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶中，具有轉(zhuǎn)移傾向一類腫瘤細(xì)胞，通過EMT等生物學(xué)行為，遷移入血稱之為CTC，其可分為具有干細(xì)胞特征的CTC和不具有干細(xì)胞特征的CTC[17]。CTC遷移入血的生物學(xué)過程目前尚無明確定論。CTC一旦遷徙入血，其存活時間一般較短，通常不會超過24 h；而且，就其形態(tài)而言，CTC具有高度的異質(zhì)性[18]。因此，即便通過最溫和的分離技術(shù)，循環(huán)還是經(jīng)常可以檢測出已經(jīng)凋亡或者破壞的CTC。

循環(huán)中檢測出CTC并不一定意味著患者已經(jīng)存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移是個相對復(fù)雜的過程。CTC侵襲入原發(fā)灶以外的第二器官（如骨髓等），可稱之為播散的腫瘤細(xì)胞（disseminated tumor cells, DTC）[19]。一般而言，具有干細(xì)胞特征的DTC聚集成團(tuán)，并且形成微轉(zhuǎn)移灶，同時該轉(zhuǎn)移灶可以逃避免疫系統(tǒng)的識別，腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移才可能發(fā)生[17,20]。在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞會表現(xiàn)出更多的間葉表型特征，失去正常情況下細(xì)胞間的相互作用，即存在上皮-間葉轉(zhuǎn)換（epithelial mesenchymal transitios, EMT）過程，從而使其更容易侵入血管內(nèi)皮而進(jìn)入血循環(huán)[21]。在 EMT過程中，腫瘤細(xì)胞下調(diào)了上皮組織特定標(biāo)記物如角蛋白（cytokeratin, CK）和上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）的表達(dá)，上調(diào)了間葉組織標(biāo)記物如波形蛋白的表達(dá)[22,23]。但是，EMT并不是一個“全或無”的過程，很多CTCs可以同時表達(dá)間葉組織標(biāo)記物和上皮組織。這對現(xiàn)行的一些CTCs的檢測方法有著重要的影響。例如針對上皮組織標(biāo)記物的檢測方法就無法檢測到發(fā)生EMT的CTCs。

另外一個重要的問題是，早期腫瘤外周循環(huán)中是否可以檢測到CTC，也就是說CTC遷移入血的過程是發(fā)生在腫瘤早期還是晚期？理論上講，腫瘤大小超過2 mm左右時便可誘導(dǎo)血管生成進(jìn)入腫瘤，提供血供，從而為腫瘤細(xì)胞遷移入血提供基礎(chǔ)。Husemann等[24]通過研究證實(shí)，在轉(zhuǎn)基因小鼠種植后約17-18周，循環(huán)中即可檢出CK與HER同時陽性表達(dá)的細(xì)胞，而此時原發(fā)腫瘤體積還小于1 mm3。另有研究[25,26]結(jié)果也再次印證了上述結(jié)果，其中He等將表達(dá)中等量葉酸受體（folate receptor, FR）的M109鼠肺癌細(xì)胞通過皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部側(cè)面。移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分鐘可以檢測到大約1.4個CTC細(xì)胞。而到了移植后的第3和4周，則每分鐘可分別檢測7和18個CTC。隨著腫瘤逐漸增大，CTC的數(shù)量呈指數(shù)級別上升。在腫瘤移植的前4周內(nèi)，沒有在任何組織切片中發(fā)現(xiàn)到存在轉(zhuǎn)移性癌癥的跡象。因此，理論上而言，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期，循環(huán)中即可檢出CTC。

基于CTC的生物學(xué)特征，有學(xué)者[27]認(rèn)為，CTC可用于評估腫瘤發(fā)生發(fā)展的狀態(tài)與治療的療效。且目前的檢測方法均是用循環(huán)中單位體積血液中CTC的數(shù)量用以進(jìn)一步的分析與評估整體病情。因此，CTC在肺癌領(lǐng)域可以發(fā)揮類似腫瘤標(biāo)志物的作用，用于肺癌的輔助診斷、治療療效的評估、術(shù)后隨訪中監(jiān)測復(fù)發(fā)。另一方面通過CTC的進(jìn)一步分析，其亦可用于檢測肺癌分子表達(dá)譜從而指導(dǎo)臨床治療或者探索肺癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)行為。

1.3 CTCs的檢測方法由于CTCs在其外周血中的數(shù)量很少，每105-107個有核細(xì)胞中才有一個CTCs[28]，因此對CTCs的檢測技術(shù)要求更為準(zhǔn)確、敏感。CTCs的檢測方法主要分為兩部分：CTC富集技術(shù)和CTC檢測技術(shù)。

目前能夠檢測到外周血中的CTCs的很多方法利用諸如EpCAM、CK等上皮特異性標(biāo)記物等，但是這些標(biāo)記物在CTCs中的表達(dá)多樣，并且存在EMT，因而檢測結(jié)果可能偏低[29]。另外，EpCAM也不是在所有類型的上皮細(xì)胞癌中都有表達(dá)。通常情況下，血細(xì)胞不表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)記物，但一部分白細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞，其CK染色和其他的一些上皮細(xì)胞特異性抗原染色卻呈陽性[30]。因此，同時進(jìn)行多種上皮細(xì)胞標(biāo)記物陽性染色和白細(xì)胞標(biāo)記物CD45的陰性染色，成為檢測 CTCs 的常規(guī)方法。但是，最近有非常多的新型檢測方法，已經(jīng)顯示出較為確切的臨床價值。

總體而言， CTCs的檢測方法很多，而理想的CTC檢測方法應(yīng)該是：高敏感度，易于臨床應(yīng)用和結(jié)果可重復(fù)（表1）。

1.3.1 CTCs富集技術(shù) CTCs的富集方法主要基于CTCs的物理學(xué)特征（大小、密度、電極、可變行性）和生物學(xué)特性（細(xì)胞表面蛋白、生存能力和侵襲性）進(jìn)行富集。常用的富集方法有：①密度梯度離心法：利用商品化的分離液，將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡，根據(jù)血液中各種細(xì)胞的密度不同，離心后各種細(xì)胞成分分層，從下向上依次為：紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、分離液、單個核細(xì)胞（包括CTCs），最上層是血漿，為防止離心前血細(xì)胞與分離液混合而不利于分離，建立了OncoQuick 方法，用一種專用的50 mL試管，在分離液與血液之間放置多孔屏障，這種方法的局限性是部分腫瘤細(xì)胞可遷移至血漿層或在離心管底部形成非特異性的聚合物而丟失 CTCs[31]。②膜過濾法：2000年主要是利用腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞大小不同來分離CTCs的ISET（isolation by size epithelial tumor cells）技術(shù)被Vona等[32]提出，血液通過孔徑8 μm的濾膜過濾，使CTCs聚集于濾膜上，達(dá)到富集作用。離心法是在濾膜原理基礎(chǔ)上，利用一個內(nèi)置多孔屏障的專用50 mL試管進(jìn)行密度梯度離心，避免了全血各個層面的交叉污染，檢出率明顯高于其他方法[33]。此類富集技術(shù)簡單、方便，可以普遍使用。適合富集任何類型腫瘤的CTCs，富集的CTCs可以繼續(xù)后續(xù)免疫學(xué)和基因檢測。但由于需要血液標(biāo)本量大，而且容易出現(xiàn)交叉污染和CTCs的丟失，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。過濾法尤其會丟失直徑小于濾膜孔徑的更有侵襲性的CTC。同時，處理時間過長也是其局限之一。③免疫磁珠分離法：免疫磁珠分離法將抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和免疫磁珠的富集分離作用相結(jié)合，達(dá)到特異性的生物活性物質(zhì)和細(xì)胞的富集效果，并可對細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。從原理上分為陽性（正向）富集和陰性（負(fù)向）富集。陽性富集通過腫瘤相關(guān)性抗原的抗體直接從外周血中富集得到CTCs，多為基于CTC的某一特征（如表達(dá)EpCAM）的正向富集，雖然這類技術(shù)分離的CTC純度較高，但是會造成某些不具有這些特征（如表達(dá)EpCAM）的CTC的遺失，讓分析從一開始就具有偏向性。陰性富集是通過白細(xì)胞相關(guān)性抗原CD45等去除白細(xì)胞，最大程度的將最易干擾CTC檢測的白細(xì)胞去除，以此逐步將血液中的血漿、紅細(xì)胞和白細(xì)胞去除，最大程度的保留了稀有的CTC，實(shí)現(xiàn)了CTC近100%的回收和富集。上皮細(xì)胞通常表達(dá)EpCAM、CK和BerEP4，而血細(xì)胞不表達(dá)，正常血液中亦無上皮細(xì)胞，90%的實(shí)體瘤來源于上皮細(xì)胞，因此，針對 EpCAM、CK和BerEP4分子的抗體能用于CTCs的分選。目前CellSearch系統(tǒng)就是基于EpCAM陽性富集得到CTCs，用于臨床檢測轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌患者外周血中的 CTCs[34]。④微流體芯片（micro-fluidic chip）分離技術(shù)：微流體芯片分離技術(shù)可以用來處理更大容量的血液標(biāo)本，可以檢測出血液中極微量癌細(xì)胞的微流體硅芯片，其表面有數(shù)萬個包被抗體的微位點(diǎn)，當(dāng)血液樣本流過芯片時，該抗體可與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，因而被粘附在芯片上。目前已經(jīng)成功開發(fā)出第二代機(jī)器，為HB-Chip（herringbone-chip）[35]，為CTCs更精細(xì)的分析奠定了基礎(chǔ)。

1.3.2 CTCs檢測技術(shù) CTCs的檢測也是通過對CTCs特異表達(dá)的腫瘤或上皮蛋白或mRNA來進(jìn)行的。主要方法包括配體靶向PCR法（ligand-targeted PCR method, LTPCR）、免疫熒光法（immunofluorescence, IF）、流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry, FCM）、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reversetranscriptase PCR, RT-PCR）和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（enzymelinked epithelial immunospot assay, ELISPOT）。①LT-PCR：該方法是目前最新的CTC檢測技術(shù)，而且為國內(nèi)原創(chuàng)。其原理是肺癌等CTC表面會過量表達(dá)某些特異性受體，如葉酸受體（folate receptor, FR）[26]，靶向PCR利用的配體類似物交聯(lián)核苷酸片段作為檢測探針，通過細(xì)胞表面特異性受體與其配體類似物的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)探針與CTC細(xì)胞的結(jié)合，從而將CTC數(shù)目轉(zhuǎn)化為探針的數(shù)目，并且通過對探針的PCR定量檢測來計算CTC的數(shù)目。傳統(tǒng)的細(xì)胞免疫熒光分析往往對純度要求很高，負(fù)向富集純度往往滿足不了。由于具有受體配體結(jié)合（1個CTC表面存在上萬個特異性受體）及PCR的兩次信號放大，從而可使1個CTC信號放大約1012倍。因此，配體介導(dǎo)的靶向PCR法，具有超高的靈敏度的特點(diǎn)，從而使早期肺癌中探測CTC成為了可能。目前，已有多篇文獻(xiàn)[36,37]報道了該種方法在肺癌的輔助診斷中的作用。其主要通過FR識別肺癌CTCs。已有發(fā)表的組織活檢數(shù)據(jù)[38-41]顯示約83%的肺癌細(xì)胞表面過量表達(dá)FR。人FR有三種亞型：FR-α、FR-β和FR-γ。FR-α的表達(dá)具有很強(qiáng)的組織和腫瘤特異性，除在少數(shù)正常組織（腎、胎盤、脈絡(luò)叢）有表達(dá)之外，在其他正常組織中表達(dá)水平非常低。是一種理想的CTCs篩選靶標(biāo)，保證了特異性。②IF：IF是指以熒光標(biāo)記的特異性抗體在CTC原位通過抗原抗體反應(yīng)，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。該技術(shù)的優(yōu)勢在于CTC的鑒定與可視化上，通常而言，認(rèn)為循環(huán)中有核細(xì)胞的CK陽性而CD45陰性可鑒定為CTC[42]，可伴有或者不伴有其他特殊類型的細(xì)胞表面受體陽性（如前列腺癌中的雄激素受體）[43]。但是，對于部分但形態(tài)學(xué)判斷為CTC但CK陰性/CD45陰性，或者CK陽性/CD45陰性但形態(tài)學(xué)上小于白細(xì)胞的CTC則需要有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生來判讀。另一方面，由于采用熒光顯色，1個CTC在顯微鏡下通常只有一個熒光顯像，所以缺乏信號放大的過程，總體而言該方法的特異性較高但敏感性較低。目前國際上最常用的CellSearch CTC檢測系統(tǒng)便是使用免疫熒光法，但是目前只被批準(zhǔn)適用于轉(zhuǎn)移性的乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌的CTCs的檢測[44-46]。Tanaka等[47]有研究證實(shí)，其在肺癌領(lǐng)域的敏感性較低，通過CellSearch系統(tǒng)檢測101例原發(fā)性肺癌患者的CTCs，發(fā)現(xiàn)在7.5 mL外周血中，只有32%的IV期肺癌患者外周血能見到CTCs，IIIa期患者的檢出率為0[48]。這主要是因?yàn)镃ellSearch系統(tǒng)主要通過上皮表型EpCAM來識別CTCs。而肺癌CTC在遷移入血的過程中通常會發(fā)生EMT，從而丟失了上皮細(xì)胞特征[49]。因此，以上皮表型EpCAM來檢測肺癌CTCs的方法，可能會產(chǎn)生假陰性的結(jié)果。③FCM：FCM是一種在功能水平上對單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測手段。他可以高速分析上萬個細(xì)胞，同時從一個細(xì)胞中測得多個參數(shù)。他利用熒光抗體結(jié)合腫瘤細(xì)胞使腫瘤細(xì)胞染色，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，還可以對同一個細(xì)胞有關(guān)物理、化學(xué)方面的特性做多參數(shù)分析。與傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。④RT-PCR：RT-PCR的指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏的技術(shù)，是PCR的一種廣泛應(yīng)用的變形，標(biāo)記組織或腫瘤中某種物質(zhì)的mRNA作為檢測指標(biāo)，可以檢測很低拷貝數(shù)的RNA。通過RT-PCR法擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞特異性或組織特異性基因，能高度靈敏地從106-107個正常細(xì)胞中檢測出1個腫瘤細(xì)胞，較免疫熒光至少靈敏100倍，是目前檢測腫瘤隱匿微轉(zhuǎn)移最有效的方法[50]。此方法的局限性在于合適的目的基因選擇困難，樣本污染容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，檢測時需要裂解細(xì)胞限制了CTCs的進(jìn)一步使用。⑤ELISPOT：ELISPOT利用活細(xì)胞能產(chǎn)生或分泌特異性蛋白的特性，與包埋在培養(yǎng)皿底部的熒光抗體結(jié)合，通過檢測熒光而間接檢測CTCs，這種方法首先應(yīng)用免疫磁珠分選去除CD45陽性細(xì)胞，富集CXCR4（腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白）陽性的細(xì)胞，從而進(jìn)一步檢測分泌特異性蛋白的CTCs。但這種方法只能識別活細(xì)胞，因?yàn)樗劳龅募?xì)胞不能夠分泌足夠的蛋白用于檢測[51]。

1.4 CTCs的臨床應(yīng)用

1.4.1 輔助診斷 目前對肺癌的診斷和分期主要基于影像學(xué)或病理學(xué)檢查的結(jié)果，對于精確反映腫瘤細(xì)胞血循環(huán)微轉(zhuǎn)移對患者治療及預(yù)后的影響有一定難度，而CTCs檢測則可以彌補(bǔ)這一缺陷。腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑是血液系統(tǒng)，判斷臨床分期的標(biāo)準(zhǔn)之一是是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。研究結(jié)果表明，CTCs與腫瘤分期密切相關(guān)，對肺癌診斷具有潛在的應(yīng)用價值[47,59,60]。Sher等[14]研究發(fā)現(xiàn)晚期肺癌患者外周血CTCs陽性率明顯高于早期患者，提示結(jié)合患者外周血情況，能更準(zhǔn)確反映患者的疾病分期和病情發(fā)展傾向。如上所述的FR靶向PCR CTC檢測技術(shù)，通過受試者工作特征曲線 （receiver operating characteristic curve，ROC曲線）分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)確定以8.64 CTC Units/3 mL作為cutoff值時，其診斷肺癌的敏感度為80%，特異性為88%。特別值得一提的是，該方法對I期NSCLC患者的診斷靈敏度達(dá)到67.2%。II期、III期、IV期NSCLC患者陽性檢出率分別為69.4%、80.9%、100%。與一般腫瘤標(biāo)志物（NSE、CEA、CYFRA211等）相比，基于FR靶向PCR的CTC檢測方法具有更大的曲線下面積（0.823）和約登指數(shù)（0.573），且更易去辨別患者是NSCLC還是健康志愿者/肺部良性疾病患者?？傮w而言，該方法對于肺癌輔助診斷的敏感度（特別是早期肺癌患者的診斷）顯著優(yōu)于目前常用的一般腫瘤標(biāo)志物[37]。

另外，CTCs可在患者出現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)移前提供預(yù)后信息，提高風(fēng)險評估，并為需要治療的患者作出指示，所以CTCs檢測有可能應(yīng)用于國際分期系統(tǒng)，作為腫瘤分期的有益補(bǔ)充[61]。

1.4.2 復(fù)發(fā)監(jiān)測 由于CTC可以評估腫瘤的發(fā)生發(fā)展?fàn)顟B(tài)，而且手術(shù)切除原發(fā)灶后，血液中CTC數(shù)量應(yīng)該為陰性。因此，理論上而言，在術(shù)后監(jiān)測過程中，CTC數(shù)量陽性，可能提示腫瘤存在復(fù)發(fā)的可能性。

目前僅有少數(shù)研究在這方面進(jìn)行了探索，Sawabata等[62]對9例接受肺葉切除術(shù)的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者進(jìn)行了術(shù)前術(shù)后的CTC檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1例患者術(shù)前在外周血中檢出CTC，而有3例患者在手術(shù)后即刻檢測中在外周血中發(fā)現(xiàn)了CTC，所有患者在術(shù)后10 d以后均無法檢出CTC。對于CTC在復(fù)發(fā)監(jiān)測中的作用，仍需更多研究來探索。

1.4.3 療效評估 目前的研究顯示，CTCs數(shù)目和腫瘤的進(jìn)展、接受藥物治療后的療效密切相關(guān)[63,64]。Punnoose等[65]用細(xì)胞搜索系統(tǒng)檢測了41例患者外周血的CTCs數(shù)量，這些患者參加了厄羅替尼及pertuzumab治療NSCLC的單臂二期臨床試驗(yàn)，研究者對其療效進(jìn)行氟代脫氧葡萄糖-正電子發(fā)射型計算機(jī)斷層顯像（fluorodeoxyglucose-positron emission computed tomography, FDG-PET）和計算機(jī)斷層掃描（computed tomography, CT）評價，78%的患者在基線水平上可檢測到大于1個CTCs，在評估療效上CTCs數(shù)量的減少與FDG-PET影像學(xué)檢查和按照實(shí)體瘤的療效評價標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果一致并與較長的疾病進(jìn)展期（progression-free survival, PFS）相關(guān)，CTCs的減少是治療有效的早期指標(biāo)。另有一項(xiàng)研究評估了CTC數(shù)量波動對化療療效的評估作用。研究共檢測了25例轉(zhuǎn)移性肺癌患者接受化療前和化療2個周期后的CTC數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CTC數(shù)量的前后變化與影像學(xué)表現(xiàn)一致，CTC下降、無變化、上升患者的無進(jìn)展生存期分別為2.05個月、3.25個月和8.35個月（P＜0.05），提示CTC比一般腫瘤標(biāo)志物更能反映腫瘤接受化療后的變化[56]。

1.4.4 評估肺癌分子表達(dá) 如基因表達(dá)分析和全基因組分析等現(xiàn)代基因工程技術(shù)正在越來越多地用于提供CTCs分子結(jié)構(gòu)上的信息，已檢測到CTC的基因異常與原發(fā)灶癌細(xì)胞基本一致，包括基因擴(kuò)增和（或）幾種癌基因的等位基因缺失[66]、不正常的端粒酶活性[67]和非整倍體的變化[68]。CTCs上亦可檢測到惡性腫瘤的分子足跡[69]。如CTCs上各類上皮蛋白質(zhì)可能為轉(zhuǎn)移提供特異性標(biāo)記[70]如細(xì)胞骨架相關(guān)細(xì)胞因子、信號激酶、生長因子受體或表面粘附分子等的變化。

另外，NSCLC特別是肺腺癌在接受治療前必需先同時評估EGFR與ALK基因狀態(tài)，以此指導(dǎo)后續(xù)靶向治療。雖然，大部分方法檢出CTC的敏感度較低，但是一旦富集出CTC，其檢測肺癌EGFR突變與腫瘤組織對比具有較高的一致性。Maheswaran等[15]從20個外周血中檢測出CTC的NSCLC患者中，組織與外周血CTC對EGFR突變檢測的一致率達(dá)到了95%，同時亦可以通過檢測T790M突變監(jiān)測患者的耐藥。另一項(xiàng)發(fā)表在J Clin Oncol的研究[71]則評估了在CTC中用FISH方法檢測ALK融合基因的可行性。研究共檢測了32例晚期NSCLC患者CTC中ALK融合基因表達(dá)，其中18例組織學(xué)檢測為陽性患者中，CTC均為ALK陽性（ALK陽性細(xì)胞數(shù)大于4個），14例組織學(xué)ALK陰性的患者，CTC中ALK陽性細(xì)胞表達(dá)僅為小于等于1個；并且，CTC中ALK陽性細(xì)胞數(shù)可用于評估克唑替尼治療的療效。

如上所述，CTC用于肺癌分子基因診斷的不足之處在于CTC本身的檢出率低，但就目前的研究結(jié)果來看，一旦外周血中富集出足夠量的CTC，其基因檢測與組織學(xué)對比的一致率較高。因此，需要富集效率更高的方法，能夠最大程度上完整保留外周血中的CTC，成為此方面研究探索的重要方向。

2 ctDNA

血漿游離DNA（cell-free DNA, cfDNA）是外周血中游離存在、不包含在完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)的DNA。循環(huán)系統(tǒng)中存在cfDNA早已得到證實(shí)。目前，cfDNA可能來源于以下三種情況：①來自于細(xì)胞的凋亡進(jìn)程中片段化的DNA；②來自于壞死的細(xì)胞的DNA碎片；③來自于細(xì)胞分泌的exosome。其中，cfDNA主要來源于細(xì)胞凋亡。

循環(huán)腫瘤DNA（ciuculating tumor DNA, ctDNA）是指腫瘤細(xì)胞體細(xì)胞DNA經(jīng)脫落或者當(dāng)細(xì)胞凋亡后釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。ctDNA是人體血液循環(huán)系統(tǒng)中不斷流動的攜帶一定特征（包括突變、缺少、插入、重排、拷貝數(shù)異常、甲基化等）來自腫瘤基因組的DNA片段。ctDNA就是來源于腫瘤細(xì)胞的cfDNA[72]，屬于cfDNA的一種類型。ctDNA不同于遺傳突變的是其來自腫瘤細(xì)胞的體細(xì)胞突變，而cfDNA存在于體內(nèi)的每個細(xì)胞[73]。ctDNA來源：①來自于壞死的腫瘤細(xì)胞；②來自于凋亡的腫瘤細(xì)胞；③CTC；④來自于腫瘤細(xì)胞分泌的外排體[74]。

2.1 ctDNA分析技術(shù) 由于腫瘤特異性的ctDNA并不存在于正常細(xì)胞中，他們?yōu)榘┌Y檢測提供了一種十分敏感和特異的方法。血漿收集技術(shù)層面也許會影響ctDNA水平。由于脫氧核糖核酸酶活性，ctDNA在血液中穩(wěn)定性有限，因此抽血后，包括cfDNA的準(zhǔn)備步驟在內(nèi)不能超出數(shù)小時。通常而言，外周血中每毫升血漿中含有17 ng的DNA[74]，但其中ctDNA含量低，約占整個循環(huán)DNA的1%，甚至只有0.01%[75,76]。檢測ctDNA的第一步是抽提外周血中的游離DNA，目前較為通行的抽提方法大約需要1毫升血清或者血漿（3 mL全血，乙二胺四乙酸抗凝），抽血后4 h-5 h內(nèi)即需要完成抽提步驟。在肺癌領(lǐng)域，ctDNA中檢測單個基因突變（如EGFR突變）的檢測方法較多，如液相色譜法、突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)（amplification refractory mutation system, ARMS）法、數(shù)字PCR、二代測序法等?？傮w而言，BEAMing數(shù)字PCR法的敏感性最高，可達(dá)0.01%，其他方法的敏感性約為1%[77]。中國學(xué)者在這方面也報道了較多的關(guān)鍵研究。2009年王潔教授有研究[78]報道了其用液相色譜法在230例NSCLC患者的外周血中檢測EGFR突變的研究。結(jié)果顯示，患者血漿與組織中EGFR突變的一致率87%，其中組織EGFR突變的77例患者中，63例血漿中檢出EGFR突變；組織EGFR野生型的153例患者中，137例血漿中檢出EGFR野生型，血漿與組織的相關(guān)系數(shù)為0.74。在2015年歐洲肺癌年會公布的IGNITE研究[79]中，研究者比較了2,581例NSCLC患者配對的組織學(xué)或者細(xì)胞學(xué)標(biāo)本與ctDNA標(biāo)本的EGFR突變吻合度。結(jié)果顯示，在真實(shí)世界中，血液檢測較組織學(xué)/細(xì)胞學(xué)檢測具有較高的特異性，在亞太地區(qū)患者中達(dá)到97.2%，說明血液檢測的假陽性率低，血液檢測EGFR基因突變的敏感性為49.6%，血漿與組織的一致率為58%。就上述兩篇研究可以看出，ctDNA檢測EGFR突變的特異性較高，而敏感性較低，因此對于血漿EGFR突變陰性結(jié)果的解讀必需慎重。

就目前而言，對肺癌患者的ctDNA進(jìn)行多基因甚至是全基因組分析，大部分使用的是二代測序技術(shù)。而二代測序技術(shù)中，常規(guī)的全基因組分析方法由于cfDNA中腫瘤基因組的含量較少，非常容易被大量生殖系基因組學(xué)變異（如基因融合與基因拷貝數(shù)增加）所埋沒。另一方面，如需檢測ctDNA中的ALK融合或者ROS1融合，由于包含融合點(diǎn)的DNA序列更為稀少，因此，對二代測序法的測序深度提出了極高的要求[76,80,81]。這一困難，目前正在被新的二代測序技術(shù)所逐漸解決。2014年Nature Medicine雜志中，Newman等[82]使用一種稱之為深度測序腫瘤個體化建檔法（cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPPSeq）的超敏感二代測序法檢測非小細(xì)胞患者的ctDNA中特定的腫瘤基因變異。該方法的主要原理為采用RNA探針捕獲技術(shù)結(jié)合二代測序平臺檢測基因組變異，由于只需擴(kuò)增探針捕獲的目標(biāo)DNA序列，且在捕獲片段的兩端加上接頭使每一條DNA片段的3'端和5'端完全相同，因此在測序深度能大大提高的同時保證了擴(kuò)增的特異性。因此，可有效檢測ctDNA中的包括ALK與ROS1融合在內(nèi)的各種基因突變。

2.2 ctDNA的臨床應(yīng)用 在1989年，Stroun等[83]首先對腫瘤患者體內(nèi)的游離循環(huán)DNA的序列進(jìn)行了檢測，在腫瘤患者體內(nèi)的游離循環(huán)DNA上相繼檢測到K-ras、N-ras、P53、APC等基因的突變。近年來有較多研究對ctDNA的臨床應(yīng)用進(jìn)行了探索。但是在循環(huán)腫瘤標(biāo)志物中，ctDNA與CTC因其來源不同，評價標(biāo)準(zhǔn)不同，生物學(xué)特征不同，兩者可能側(cè)重于不同方面的臨床應(yīng)用（表2）[84-86]。

2.2.1 肺癌驅(qū)動基因檢測 由于ctDNA檢測基因變異相對快速、便捷，可應(yīng)用高通量的測序方法，并且部分腫瘤外周血中ctDNA的表達(dá)水平高于CTC。因此，對于基因檢測方面，雖然兩者可互為補(bǔ)充，但可能ctDNA更具一定優(yōu)勢[87,88]。對于EGFR突變檢測，如上所述的研究已經(jīng)證實(shí)了ctDNA檢測EGFR突變的可靠性。因此，美國和中國均已有官方批準(zhǔn)的血漿檢測EGFR突變的商業(yè)試劑盒。對于ALK融合基因檢測，目前尚無明確的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，有文獻(xiàn)報道使用濾膜法聯(lián)合FISH探針可檢測到外周血CTC中的融合基因。針對ctDNA，CAPP-Seq則是較為可行的檢測方法之一，但其問題在于DNA層面，融合基因的融合位點(diǎn)往往都在內(nèi)含子部分，且大部分為隨機(jī)斷裂，因此捕獲探針的設(shè)計便顯得尤為重要。一般而言，由于特異性較高，且有大量文獻(xiàn)證實(shí)，ctDNA中檢出EGFR敏感突變可用于指導(dǎo)臨床治療的參考，而檢測ALK融合基因或者其他驅(qū)動基因表達(dá)則需要進(jìn)一步的臨床數(shù)據(jù)來證實(shí)。

表1 肺癌領(lǐng)域CTC檢測技術(shù)列表Tab 1 CTC enrichment and detection technologies in lung cancer

表2 CTC和ctDNA臨床應(yīng)用Tab 2 Clinical application of CTC and ctDNA

2.2.2 肺癌輔助診斷 由于ctDNA來源于腫瘤細(xì)胞的壞死和凋亡，因此，理論上來說，早期腫瘤外周血中即可能存在ctDNA，但是可能極為微量。二代測序方法與微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）的敏感度均較ARMS法敏感度高，且可以同時分析多個變異的基因。因此，通過檢測ctDNA來輔助診斷肺癌方面，二代測序法具有比較明顯的優(yōu)勢。有研究通過CAPP-Seq方法檢測13例肺癌患者和5名健康人外周血中的游離DNA，通過檢測其中突變或者融合基因來輔助診斷肺癌。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)總體而言，II期-IV期肺癌與I期肺癌的敏感性分別為100%與50%，特異性為96%，對于所有肺癌患者診斷的AUC值為0.89。而且ctDNA的表達(dá)量與腫瘤大小相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.89（P=0.000,2）。由此，研究者認(rèn)為基于高通量的二代測序技術(shù)檢測ctDNA中的腫瘤基因變異可用于診斷NSCLC。但是，畢竟ctDNA與CTC不同，循環(huán)中游離DNA的來源各異，無法判別來源，且不同時間點(diǎn)游離DNA的表達(dá)量亦不相同。另一方面，肺癌的異質(zhì)性較大，突變譜也較廣泛[89]，通過ctDNA診斷肺癌的標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一，是否循環(huán)中檢測到某種基因變異或者某幾類基因變異的組合即可診斷肺癌，目前尚無定論。而對肺癌患者的腫瘤組織和相應(yīng)的血漿血清中的游離循環(huán)DNA進(jìn)行一些基因啟動子區(qū)的甲基化檢測，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的肺癌患者都存在一些基因啟動子區(qū)高甲基化的現(xiàn)象[90]。這個方法因此也可以被用來肺癌患者的早期診斷和存活率的檢測中。在肺癌患者體內(nèi)的游離循環(huán)DNA中存在雜合性丟失（loss of heterozygosity, LOH）和基因啟動子區(qū)的甲基化[91]，這一發(fā)現(xiàn)說明游離循環(huán)DNA也許可以用于判斷個體是否存在發(fā)生肺癌的風(fēng)險。

2.2.3 靶向藥物耐藥監(jiān)測 眾所周知，存在驅(qū)動基因突變的NSCLC患者需接受相應(yīng)的靶向治療。但是，目前的靶向治療藥物，無論是EGFR還是ALK抑制劑均會在10個月左右出現(xiàn)耐藥[7,92]，與此同時對于這部分患者耐藥的準(zhǔn)確判定，實(shí)體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST）可能并不完全適用[93]。另一方面，酪氨酸結(jié)構(gòu)域的二次突變是導(dǎo)致酪氨酸激酶抑制劑耐藥的重要原因之一[7]。因此，通過ctDNA檢測獲得性耐藥基因的表達(dá)，成為了目前研究的重點(diǎn)方向之一。

2013年，Murtaza等[94]在Nature雜志上發(fā)表了其利用血漿DNA檢測觀察腫瘤治療后獲得性耐藥的研究。其動態(tài)觀察了6例腫瘤患者（2例乳腺癌、2例卵巢癌、2例肺癌）接受相應(yīng)治療后的1年-2年時間中，外周血DNA腫瘤突變數(shù)量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外周血中突變負(fù)荷的增加與治療的耐藥密切相關(guān)。其中一例接受吉非替尼治療的患者在耐藥時外周血中檢出了T790M突變。在接受EGFRTKIs治療的EGFR突變患者中，ctDNA中檢測T790M突變的技術(shù)方法較為普遍。而且，2015年美國臨床腫瘤學(xué)會（American Society of Clinical Oncology, ASCO）年會中口頭報告了ctDNA中T790M突變與三代EGFR-TKIs Rociletinib治療之間的關(guān)系，存在T790M突變患者的有效率為53%，疾病控制率為82%，兩者具有明確的相關(guān)性[95]。2015年發(fā)表在Nature Medicine中關(guān)于三代EGFR-TKIs耐藥機(jī)制的研究報道，更是提示ctDNA檢測在這一方面的前景。該研究通過隨訪15例T790M突變的患者接受AZD9291治療，動態(tài)監(jiān)測ctDNA，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了AZD9291獲得性耐藥的突變位點(diǎn)C797S[96]。并且通過動態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)AZD9291存在三種耐藥模式 ，一種是耐藥后T790M突變與C797S突變同時存在，一種是耐藥后僅出現(xiàn)T790M的再次升高，第三種是耐藥后即不伴有T790M也無C797S的出現(xiàn)。

3 小分子RNA（mircoRNA, miRNA）和長鏈非編碼RNA（Long Non-coding RNA）

在生物基因組中 廣泛存在一類非編碼蛋白的RNA基因，其轉(zhuǎn)錄物在某種機(jī)制下被加工成長度大約20個-24個核苷酸的小RNA，他們因此被命名為miRNA。這類RNA表達(dá)譜可以作為某些組織或細(xì)胞的特異性分子標(biāo)志，具有調(diào)節(jié)其他基因表達(dá)的活性，在生物發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。

至今為止，真正確認(rèn)功能的miRNA還是微乎其微，雖然現(xiàn)在已經(jīng)找到了1,000個以上miRNA，并提出他們在細(xì)胞增殖、分化、代謝與死亡中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。Lin-4、Let-7的靶基因是ras信號通路的蛋白[97-99]；Lin-41、hbl-1、Lin-14和Lin-28調(diào)控時序發(fā)育[100]等。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）是一類本身不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的長鏈非編碼RNA分子，他可在多層面上（表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等）調(diào)控基因的表達(dá)。lncRNA最初被認(rèn)為是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，是一種“噪音”，不具有生物學(xué)功能。然而，近年來的研究表明，lncRNA參與了X染色體沉默、染色體修飾和基因組修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)冗^程，越來越多的人正在研究其調(diào)控作用[101]。

4 小結(jié)

通常來說，保證特異性前提下的高敏感度、便于臨床應(yīng)用、可重復(fù)性好是CTC與ctDNA檢測技術(shù)的三個重要評判標(biāo)準(zhǔn)。較高敏感度可保證在數(shù)以億計的背景細(xì)胞或者基因組中有效檢出CTC或者ctDNA；便于臨床應(yīng)用是考慮該技術(shù)應(yīng)用于臨床的便利性（如檢測時間、價格、所需樣本大小等）；可重復(fù)性則保證了臨床應(yīng)用的可靠性。因此，從科研探索走向真正的臨床應(yīng)用前，“液態(tài)活檢”[102]的各項(xiàng)檢測技術(shù)需要通過大規(guī)模的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。否則，只能限制用于科研探索。

CTC和ctDNA仍有不少問題值得我們?nèi)ヌ剿?。關(guān)于CTC，外周血中的CTC大部分為具有轉(zhuǎn)移傾向的，對其分子生物學(xué)特征的理解有助于我們探索腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制；CTC的富集技術(shù)已經(jīng)日趨成熟，通過高效的富集方法，能否通過病理學(xué)手段對循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行病理學(xué)判定，有助于我們對患者進(jìn)行真正的無創(chuàng)“液態(tài)活檢”。關(guān)于ctDNA，ctDNA中檢測出的基因變異（EGFR或者ALK）是否可以直接指導(dǎo)臨床治療，我們需要進(jìn)一步的數(shù)據(jù)來證實(shí)；EGFR突變患者使用靶向治療耐藥的過程中，RECIST標(biāo)準(zhǔn)往往評價不夠完整，如何通過血液監(jiān)測耐藥突變（T790M）的豐度來指導(dǎo)我們的耐藥，也非常值得臨床探索。

在將來，隨著我們檢測方法的不斷進(jìn)步，期待液態(tài)活檢技術(shù)能夠真正應(yīng)用到臨床，指導(dǎo)肺癌精準(zhǔn)治療，成為延長患者生存期的必備手段！