徐令東　陳萌　張華等

摘要： 采用福美雙誘導(dǎo)建立肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良（tibial dyschondroplasia，TD）模型，研究甲狀旁腺素相關(guān)肽-印第安刺猬蛋白（PTHrP-Ihh）信號(hào)軸在肉雞發(fā)生脛骨軟骨發(fā)育不良中的調(diào)控機(jī)制。100羽1日齡健康Ross308肉雞經(jīng)1周預(yù)飼后，隨機(jī)分為2組，對(duì)照組飼以基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組在飼喂8、9 d時(shí)飼以基礎(chǔ)日糧并添加100 mg/kg福美雙，之后繼續(xù)飼以基礎(chǔ)日糧；于15日齡時(shí)采集組織樣本，進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組體質(zhì)量極顯著降低，但TD 發(fā)生率極顯著升高；脛骨與肱骨的骨長(zhǎng)度、骨密度，脛骨與股骨的骨強(qiáng)度均顯著或極顯著降低，而肱骨的骨指數(shù)顯著增強(qiáng)；TD肉雞脛骨生長(zhǎng)板軟骨組織Ihh、PTHrP的mRNA表達(dá)極顯著下降，ColⅩmRNA表達(dá)極顯著上升。試驗(yàn)表明，PTHrP-Ihh信號(hào)軸調(diào)控紊亂，會(huì)影響生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的分化和ColX表達(dá)，導(dǎo)致肉雞形成脛骨軟骨發(fā)育不良。

關(guān)鍵詞： 脛骨軟骨發(fā)育不良；肉雞；PTHrP-Ihh信號(hào)軸

中圖分類(lèi)號(hào)： S858 31 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）08-0202-03

現(xiàn)代肉雞品種的選育過(guò)程中，注重肉雞快速增質(zhì)量的選育方式對(duì)肉雞的生理機(jī)能產(chǎn)生了顯著的影響，同時(shí)導(dǎo)致腿病，尤其是脛骨軟骨發(fā)育不良（ tibial dyschondroplasia，TD）的發(fā)病率顯著增加，不僅影響動(dòng)物福利，同時(shí)也帶來(lái)了較大的經(jīng)濟(jì)損失 [1]。脛骨軟骨發(fā)育不良是現(xiàn)代肉雞養(yǎng)殖業(yè)最常見(jiàn)、危害最嚴(yán)重的骨骼疾病之一，該病以在脛骨近端生長(zhǎng)板下形成無(wú)血管、未鈣化、不透明的軟骨栓為主要特征。TD的發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜，近年來(lái)研究表明，軟骨細(xì)胞的增殖、分化、凋亡失控進(jìn)而導(dǎo)致軟骨內(nèi)成骨異?？赡苁荰D發(fā)生的重要原因之一，然而相關(guān)機(jī)理至今尚未清楚 [2]。甲狀旁腺素相關(guān)肽（parathyroid hormone-related peptide，PTHrP）-印第安刺猬蛋白（Indian hedgehog，Ihh）信號(hào)軸是軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中調(diào)節(jié)軟骨和成骨細(xì)胞增殖、分化、肥大、礦化的重要調(diào)控軸，其在肉雞TD發(fā)生中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)飼料中添加福美雙的方法，誘導(dǎo)建立肉雞TD模型，研究肉雞脛骨形生長(zhǎng)板 PTHrp-Ihh 信號(hào)軸和相關(guān)因子的變化及其相互作用關(guān)系，為探明肉雞TD 發(fā)生的機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1 1 試驗(yàn)儀器

X射線機(jī)（北京萬(wàn)東醫(yī)療裝備股份有限公司）；BS-300生化分析儀（邁瑞公司）；LR10K PLUS骨強(qiáng)度測(cè)定儀（Lloyd Instruments Ltd ，英國(guó)）；RM2235軟組織切片機(jī)（Leica，德國(guó)）；H5505光學(xué)顯微鏡（Nikon，日本）；自動(dòng)生化分析儀（Selectar E，荷蘭）；MICROTEK5600透射式掃描儀（上海中晶科技有限公司）。

1 2 試驗(yàn)材料

福美雙，購(gòu)于南京壽德試驗(yàn)器材有限公司；血漿鈣、磷、堿性磷酸酶生化檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于邁瑞公司；cDNA Synthesis Kit （M-MLV Version）、SYBR Premix Ex Taq TM試劑盒、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司。

1 3 試驗(yàn)動(dòng)物

100羽1日齡Rose308肉雞購(gòu)自南京長(zhǎng)蘆孵化場(chǎng)，隨機(jī)分為試驗(yàn)組、對(duì)照組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10羽雞。嚴(yán)格控制雞舍的溫濕度，最初2 d溫度維持在35 ℃，之后在1周內(nèi)逐漸降到21 ℃，并一直維持該溫度直到試驗(yàn)結(jié)束?？諝鉂穸染S持在45%左右。每天光照23 h，暗處理1 h。飼喂滁州正大生產(chǎn)的商品雛雞料（代謝能13 39 MJ/kg，粗蛋白230%）。試驗(yàn)期間自由采食和飲水，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧；試驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)日糧7 d后，飼喂基礎(chǔ)日糧中添加 100 mg/kg 福美雙的日糧，飼喂2 d后停止飼喂，繼續(xù)飼以基礎(chǔ)日糧直至試驗(yàn)結(jié)束。試驗(yàn)為期15 d。

1 4 試驗(yàn)方法

1 4 1 樣品的采集 在15日齡時(shí)，每組隨機(jī)挑選30羽雞，對(duì)每羽雞進(jìn)行編號(hào)、稱(chēng)質(zhì)量、心臟采血后處死。血液于37 ℃靜置30 min，然后于2 500 g離心收集血清，檢測(cè)血漿中鈣、磷、堿性磷酸酶的水平；將每羽雞左側(cè)的肱骨、股骨、脛骨取下分別裝入各自的自封袋中，-20 ℃保存?zhèn)溆?，用于骨長(zhǎng)、骨指數(shù)、骨密度、骨強(qiáng)度測(cè)定；每個(gè)處理隨機(jī)選取5羽雞，剝?nèi)∮覀?cè)脛骨，分離生長(zhǎng)板，液氮速凍后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1 4 2 肉雞TD發(fā)病率的測(cè)定 取右脛骨，縱切，參照TD評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) [3]判定TD發(fā)病程度。以每組3個(gè)重復(fù)發(fā)病率的平均值為每組的發(fā)病率，并統(tǒng)計(jì)其差異。

1 4 3 骨生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)的測(cè)定

1 4 3 1 骨指數(shù)和骨長(zhǎng)度的檢測(cè) 檢測(cè)前，將每根骨頭解凍過(guò)夜，刮除骨頭上所有的軟組織。對(duì)每根骨頭稱(chēng)質(zhì)量并用游標(biāo)卡尺測(cè)其長(zhǎng)度。骨指數(shù)的計(jì)算公式是：骨指數(shù)=骨質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（kg） [4]。

1 4 3 2 骨放射密度的檢測(cè) 將肱骨、股骨、脛骨樣本與16級(jí)鋁階（英國(guó)Roslin研究所饋贈(zèng)）置于同一暗盒上，拍片（富士醫(yī)用X線膠片，25 4cm×30 5cm）。肱骨、股骨、脛骨采用前后位拍攝，攝片條件：焦點(diǎn)膠片距80 cm，球管電壓與毫安秒分別為44kV、3 88mAs [5]。所攝X線片掃描后，用 NIH Image J 1 32j圖像處理系統(tǒng)分析掃描圖像。骨骼樣本的放射密度用毫米鋁階厚度（mm Al）表示。

1 4 3 3 骨強(qiáng)度的檢測(cè) 用三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)檢測(cè)骨強(qiáng)度 [6]。在骨骼樣本的中點(diǎn)處標(biāo)記，用游標(biāo)卡尺測(cè)量每根骨樣本此處的直徑。根據(jù)骨骼樣本長(zhǎng)度確定跨距。用骨強(qiáng)度測(cè)定儀測(cè)定骨骼強(qiáng)度。預(yù)載荷速度設(shè)為3 mm/min，骨骼斷裂時(shí)停止。通過(guò)NEXYGEN PLUS軟件分析曲線的最高點(diǎn)即為骨強(qiáng)度（單位為N）。