呂延成　潘曉瑜　黃暢等

摘要：根據(jù)乙型單純皰疹病毒（HSV-2）UL54基因序列，設(shè)計(jì)并合成特異性的小干擾片段，將其定向克隆至真核表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo中，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率，MTT法檢測HEK293細(xì)胞的存活率，RT-PCR檢測UL54基因mRNA的表達(dá)，Western blot檢測UL54基因編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)，終點(diǎn)滴定法測定細(xì)胞上清液中的病毒感染滴度。結(jié)果顯示， shRNA1081能抑制UL54 基因mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，能顯著降低子代病毒滴度，提高細(xì)胞的存活率。表明本研究構(gòu)建的重組表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-UL54 shRNA能在HEK293細(xì)胞中表達(dá)，并抑制HSV-2復(fù)制。

關(guān)鍵詞：UL54基因；RNA干擾；短發(fā)夾RNA；真核表達(dá)載體；2型單純皰疹病毒

中圖分類號：R373 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）15-3779-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.052

Abstract： In search of new anti-virus strategy，targeting herpes simplex virus type 2 （HSV-2） UL54 gene and based on the rule of shRNA design， DNA fragment targeting conserved sequences of UL54 was synthesized and cloned into a plasmid vector pGPU6/GFP/Neo， and then transferred into human embryonic kidney（HEK） 293 cells by lipofectamine. Parameters including transfection efficiency，cell survival rate， expression level of UL54 mRNA and protein， and viral titer in supernatants collected from HSV-2 infected cell， were detected by fluorescence microscopy and flow cytometry，MTT，real-time fluorescent quantitative PCR， western blotting， and end-point assay respectively. The results showed that， shRNA1081 inhibited UL54 mRNA expression and significantly decreased target gene protein expression， markedly reduced TCID50 in HSV-2 infected cells at 48 hours post-infection， and increased survival rate of cells. It revealed that pGPU6/GFP/Neo-UL54 shRNA could express in HEK 293 cells and inhibit HSV-2 replication.

Key words：UL54 gene； RNA interference； shRNA； eukaryotic expression vector； herpes simplex virus type 2

生殖器皰疹（Genital herpes， GH）是一種反復(fù)發(fā)作、難以控制的潰瘍性疾病，主要由2型單純皰疹病毒（Herpes simplex virus，HSV-2）引起，目前還無特效藥物控制HSV-2的感染和復(fù)發(fā)。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種特異性基因沉默技術(shù)，能夠使mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，它為靶向防治HSV-2提供了新思路。目前國內(nèi)外運(yùn)用RNAi技術(shù)特別是針對HSV-2的研究報道較少，其中絕大多數(shù)都是直接應(yīng)用化學(xué)合成的siRNA（Small interfering RNA）針對HSV-2進(jìn)行干擾[1，2]，但是化學(xué)合成的siRNA通過脂質(zhì)體介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞易被RNase降解，沉默效應(yīng)持續(xù)的時間較短。本試驗(yàn)采用的是通過構(gòu)建帶有RNA聚合酶Ⅲ啟動子的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)錄出具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA（Small hairpin RNA， shRNA）。shRNA在Dicer酶作用下轉(zhuǎn)化成21～25 nt的siRNA，可使構(gòu)建載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的siRNA持續(xù)時間長，穩(wěn)定性強(qiáng)，是一種較理想的RNAi研究方法。

HSV-2是雙鏈線性DNA，基因組約為150 kb，編碼70多種蛋白質(zhì)。HSV-2基因組表達(dá)具有很高的時序性，按照基因表達(dá)的先后順序可將HSV-2病毒基因分為立即早期基因、早期基因和晚期基因，其中有多個基因在病毒復(fù)制和繁殖的過程中發(fā)揮重要作用，這些主要功能基因都可能成為RNAi抑制HSV-2的靶基因。立即早期基因編碼5種細(xì)胞感染蛋白質(zhì)（Infect cell protein，ICP），包括ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47。UL54基因?qū)儆贖SV-2立即早期基因，編碼的ICP27蛋白質(zhì)是HSV-2病毒復(fù)制所必需的一種關(guān)鍵多功能蛋白質(zhì)，主要調(diào)節(jié)病毒和宿主細(xì)胞mRNA的合成與成熟，運(yùn)輸細(xì)胞核的mRNA到細(xì)胞質(zhì)中[3，4]，能激活病毒晚期基因的表達(dá)，并與ICP0、ICP4一起調(diào)控早期基因和晚期基因的表達(dá)[5-7]，刺激病毒轉(zhuǎn)錄翻譯[8]。有研究證明，ICP27蛋白質(zhì)一旦突變可影響病毒在宿主內(nèi)的復(fù)制[9，10]，在病毒的激活過程中可以激活p38與JNK信號通路而使細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡，因此ICP27被認(rèn)為在病毒激活過程中起著重要作用。所以編碼ICP27蛋白質(zhì)的UL54基因應(yīng)是特異siRNA干擾的考慮位點(diǎn)。因此，針對HSV-2 UL54基因篩選設(shè)計(jì)合適的干擾位點(diǎn)，構(gòu)建4個shRNA重組表達(dá)載體，建立pGPU6/GFP/Neo-UL54 shRNA在人胚胎腎細(xì)胞（HEK293）中高表達(dá)的模型，篩選出有效抑制UL54基因表達(dá)的shRNA干擾序列，為進(jìn)一步研究利用RNA干擾技術(shù)抑制HSV-2復(fù)制作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

HSV-2 333標(biāo)準(zhǔn)株來源于美國細(xì)胞收藏中心，HEK293和Escherichia coli DH5α由遵義醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo為上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、BbsⅠ、Pst Ⅰ為美國Fermentas公司產(chǎn)品，T4 DNA連接酶為杭州碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品，RNA提取試劑TRIzol、SYBR？誖 PrimeScript？誖 RT-PCR Kit為寶生物工程（中國大連）有限公司產(chǎn)品，DMEM培養(yǎng)基為美國GIBCO公司產(chǎn)品，新生牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000為Invitrogen公司產(chǎn)品，鼠抗ICP27單抗為Abcam公司產(chǎn)品，PCR引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 短發(fā)夾RNA（shRNA）靶序列的設(shè)計(jì)

從GenBank上獲得HSV-2（NC_001798）UL54基因序列，按照shRNA設(shè)計(jì)原則，針對HSV-2的UL54基因序列保守區(qū)域各篩選設(shè)計(jì)、合成4條干擾靶序列，分別命名為UL54 shRNA1081、UL54 shRNA1092、UL54 shRNA1276、UL54 shRNA1407，同時設(shè)計(jì)不針對任何基因的序列為陰性對照（Negative control，NC）。所設(shè)計(jì)的寡核苷酸鏈由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司化學(xué)合成，詳見表1。

1.3 pGPU6/GFP/Neo-UL54 shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

合成編碼發(fā)夾結(jié)構(gòu)shRNA的正義鏈和反義鏈分別用無核酸酶的無菌水稀釋成50 mol/L，按照退火緩沖液的說明配制退火反應(yīng)體系（Nuelease-free water 40 μL，退火緩沖液20 μL，50 μmol/L的shRNA的正義鏈和反義鏈各20 μL）。退火反應(yīng)步驟為：95 ℃ 2 min，每8 s下降1 ℃，降至25 ℃。退火產(chǎn)物儲存于-20 ℃。取pGPU6/GFP/Neo空載體用BamH Ⅰ、Bbs Ⅰ于37 ℃酶切2 h，酶切后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收，電泳鑒定后與siRNA小片段進(jìn)行連接，16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Kana抗性的LB平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落接種于含Kana抗性的LB培養(yǎng)液中，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)過夜，收集菌液，小量快速抽提質(zhì)粒DNA，提取的質(zhì)粒分別用BamHⅠ、PstⅠ雙酶切鑒定。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

HEK293細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下進(jìn)行常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)，每隔2 d換液。選取對數(shù)生長期的HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前1 d，在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板里接種500 μL的HEK293細(xì)胞（0.8×105～1.0×105個細(xì)胞/mL），37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至單層細(xì)胞匯合度為70%～80%時即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒和lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑的比例為0.8 μg∶2.0 μL，轉(zhuǎn)染48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況并利用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.5 病毒的接種及子代病毒滴度的檢測

HSV-2感染HEK293細(xì)胞，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，用終點(diǎn)滴定法檢測子代病毒滴度。按Reed-Muench法計(jì)算能引起50%細(xì)胞發(fā)生病變的病毒最高稀釋度（50% tissue culture infective dose， TCID50），即為病毒滴度。

1.6 MTT法檢測HEK293細(xì)胞存活率

按0.5×105～1.0×105個細(xì)胞/mL細(xì)胞密度接種到96孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，每孔體積100 μL，接種病毒48 h后棄上清，每孔加MTT溶液（5 mg/mL） 10 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入100 μL DMSO，脫色搖床上振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。以無細(xì)胞孔作為空白對照（僅加入MTT和DMSO），利用酶標(biāo)免疫檢測儀在波長492 nm下測定各孔光吸收值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%。

1.7 實(shí)時熒光定量PCR檢測UL54 基因mRNA的表達(dá)

Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。采用引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier 5.0設(shè)計(jì)UL54基因和管家基因GAPDH的上下游引物，以GAPDH基因作為內(nèi)參對照檢測各組細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)水平，引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，PAGE純化，濃度為0.5 μmol/μL。引物序列如下：UL54基因上游引物：5′-CCAGGACCCTATCATCGGAACG-3′，下游引物：5′-AGTATTTCAATGAGACCCGCCAT-3′；GAPDH基因上游引物：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。進(jìn)行PCR反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸32 s（共40個循環(huán)）。采用Comparative delta-delta相對定量法計(jì)算各組mRNA的表達(dá)量。

1.8 Western blot檢測蛋白質(zhì)表達(dá)

提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，采用BCA（Bicinchoninic acid）法測定細(xì)胞總蛋白質(zhì)濃度，Western blot法檢測蛋白質(zhì)表達(dá)，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，Western blot條帶經(jīng)Quantity One定量分析軟件進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-shRNA酶切鑒定結(jié)果

pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒上有Bbs Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)，在這兩個酶切位點(diǎn)之間還有一個Pst Ⅰ酶切位點(diǎn)。shRNA模板成功插入到質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo上時， Pst Ⅰ酶切位點(diǎn)被置換，因此重組質(zhì)粒能被BamH Ⅰ酶切開，不能被Pst Ⅰ酶切。Pst Ⅰ酶切結(jié)果顯示有2條帶，分別為超螺旋的SC構(gòu)型和質(zhì)粒的松弛開環(huán)OC構(gòu)型，這兩條帶表明重組質(zhì)粒不能被Pst Ⅰ酶切。重組體被BamH Ⅰ單酶切而線性化，條帶在5 100 bp左右，如圖1所示。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率測定結(jié)果

pGPU6/GFP/Neo-shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48 h后，綠色熒光蛋白質(zhì)（GFP）的表達(dá)達(dá)到高峰。倒置熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞情況如圖2所示，流式細(xì)胞儀測得轉(zhuǎn)染48 h后轉(zhuǎn)染效率如圖3所示，轉(zhuǎn)染效率最高達(dá)80.8%。

2.3 HSV-2轉(zhuǎn)染后子代的病毒滴度檢測結(jié)果

細(xì)胞接種HSV-2 48 h后，收集各組病毒上清液進(jìn)行病毒滴度的測定，病毒滴度用TCID50計(jì)算。通過終點(diǎn)滴定法測定HSV-2的TCID50，以確定感染細(xì)胞所需的病毒量。結(jié)果（表2）顯示，空白對照組TCID50為10-5.5±0.5 TU/（100 μL），其含義為將該病毒液稀釋10的（5.5±0.5）倍，接種100 μL能使50%細(xì)胞發(fā)生病變。與空白對照組（空載體）相比，干擾組UL54 shRNA1092、UL54 shRNA1276病毒滴度雖有下降，但差異不顯著（P>0.05）；其余兩干擾組病毒滴度也均有不同程度下降，差異達(dá)極顯著水平（P<0.01），其中UL54 shRNA 1081組病毒滴度下降最顯著。

2.4 UL54基因mRNA表達(dá)的實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果

接種HSV-2 48 h后，提取各組細(xì)胞內(nèi)HSV-2總RNA，利用實(shí)時熒光定量PCR法進(jìn)行目的基因的mRNA表達(dá)水平的檢測，結(jié)果（表3）顯示，UL54 shRNA1081組和UL54 shRNA1407組對UL54基因的mRNA表達(dá)抑制率分別為69.61%和51.46%，與空白對照（空載體）組相比，具有顯著性差異（P<0.05），而轉(zhuǎn)染對照組（陰性對照組）與空白對照組相比，無顯著性差異（P>0.05），UL54 shRNA1081對mRNA表達(dá)抑制率最高。

2.5 HEK293細(xì)胞存活率的MTT法檢測結(jié)果

MTT法檢測HEK293細(xì)胞存活率，結(jié)果（圖4）表明，UL54 shRNA1081組細(xì)胞存活率最高，與對照組的細(xì)胞存活率相比，差異顯著（P<0.05）。

2.6 HSV-2 UL54基因蛋白質(zhì)表達(dá)的Westernblot 檢測結(jié)果

Western blot檢測結(jié)果顯示，UL54基因表達(dá)的ICP27蛋白質(zhì)條帶位于63 ku位置（圖5A）。ICP27蛋白質(zhì)相對表達(dá)量用ICP27條帶的灰度值與內(nèi)參基因GAPDH的灰度值的比值表示，與空白對照組相比，UL54基因各干擾組的蛋白質(zhì)表達(dá)均有不同程度的降低，UL54 shRNA1081組蛋白質(zhì)表達(dá)下降最顯著（P<0.05），其次是UL54 shRNA1276組（圖5B）。

3 討論

本研究針對HSV-2 UL54基因篩選設(shè)計(jì)合適的4個干擾靶位點(diǎn)，構(gòu)建shRNA重組表達(dá)載體，該載體有GFP表達(dá)，便于觀察和檢測轉(zhuǎn)染效率。經(jīng)酶切鑒定驗(yàn)證，成功構(gòu)建了4個pGPU6/GFP/Neo-UL54 shRNA真核表達(dá)載體。HEK293細(xì)胞是HSV-2的易感細(xì)胞，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的pGPU6/GFP/Neo-UL54 shRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，利用倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測到大量綠色熒光蛋白質(zhì)表達(dá)，表明裝載到質(zhì)粒上的基因片段通過脂質(zhì)體的介導(dǎo)成功轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞，且轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80%左右，達(dá)到試驗(yàn)要求。結(jié)果表明，UL54基因特異性的shRNA1081表達(dá)載體能有效抑制HEK293細(xì)胞中mRNA和ICP27蛋白質(zhì)的表達(dá)，與空載體相比，mRNA抑制率為69.61%，對蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制效果最顯著。此外，本研究還通過觀察子代病毒滴度的變化來反映病毒的復(fù)制情況，但是肉眼觀察帶有一定的主觀性，所以還通過MTT法來檢測細(xì)胞的存活率，考察shRNA表達(dá)載體對宿主細(xì)胞的保護(hù)情況，與空載體組相比，shRNA1081表達(dá)載體能明顯降低子代的病毒滴度，細(xì)胞的存活率也最高。證實(shí)UL54 shRNA1081表達(dá)載體干擾效果較好，說明該shRNA1081真核表達(dá)載體能特異降低UL54基因的表達(dá)，在一定程度上還抑制病毒的復(fù)制，因此UL54基因是一個潛在的有效的抗HSV-2的藥物靶點(diǎn)。另外，RNAi并不能完全阻斷基因的表達(dá)，對阻斷基因mRNA的表達(dá)有一定的限度[11]，siRNA在細(xì)胞內(nèi)與RISCs（RNA-induced silencing complexes）結(jié)合后，通過其識別并沉默相應(yīng)的mRNA，RISCs有一定的飽和度，過多的siRNA反而可能抑制其活性，也不可能無限增大siRNA的濃度。因此將兩種基因或者多個基因的分子靶向治療相結(jié)合有可能治療效果更好。因此，本試驗(yàn)通過篩選出最有效抑制UL54基因表達(dá)的shRNA干擾序列，和前期研究針對不同的病毒關(guān)鍵基因如UL29[12]、UL27[13]、ICP4[14]以及已報道的UL30[15]進(jìn)行多個靶點(diǎn)shRNA的設(shè)計(jì)、篩選，為下一步利用最有效干擾序列進(jìn)行聯(lián)合干擾HSV-2復(fù)制作用奠定了基礎(chǔ)。

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