陳三春 ，張 娜 ，武書(shū)哲 ，田淑芬

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄研究中心，天津 300192；3.天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192）

選育優(yōu)質(zhì)無(wú)核葡萄是現(xiàn)代葡萄育種的研究熱點(diǎn)。20世紀(jì)80年代以前的無(wú)核品種中，70%左右都是通過(guò)有性雜交獲得的，即以無(wú)核品種做父本，有核品種做母本雜交組合中選育出來(lái)的，這種選育無(wú)核葡萄品種的方式預(yù)選困難且效率低下。1982年美國(guó)育種學(xué)家Ramming和Emershad[1]改變了傳統(tǒng)育種模式，創(chuàng)立了無(wú)核胚挽救技術(shù)，利用胚挽救技術(shù)，雖然可以進(jìn)行無(wú)核與無(wú)核品種之間的雜交，但親本選擇范圍較小。三倍體育種為無(wú)核葡萄育種開(kāi)辟了新途徑，即采用二倍體和四倍體雜交獲得三倍體后代，三倍體具有高度不育性，從而提高后代無(wú)核效率，三倍體育種是獲得大粒無(wú)核葡萄的重要育種途徑，但仍存在著植株形成率低，技術(shù)不完善等問(wèn)題。

本研究以玫瑰香優(yōu)系（歐亞種，二倍體，該優(yōu)系適應(yīng)性強(qiáng)、豐產(chǎn)、抗病性強(qiáng)，天津市農(nóng)科院葡萄研究中心通過(guò)分子標(biāo)記和田間選種結(jié)合的方法鑒別篩選出，較普通玫瑰香品種香氣濃郁，果穗松緊度適中，果粒均勻）為母本，以戶太8號(hào)和巨峰為父本，通過(guò)雜交進(jìn)行玫瑰香型大粒無(wú)核葡萄的篩選，研究取樣時(shí)期、剝胚和剪喙不同處理方式對(duì)兩種雜交組合胚挽救的影響，為三倍體育種技術(shù)提供參考。

1 試材與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2014～2015年在天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄研究中心、天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試材料為玫瑰香與戶太8號(hào)雜交胚珠、玫瑰香與巨峰雜交胚珠。

1.2 方法

在初花期采集父本的花粉，花前3～4d母本去雄，柱頭上開(kāi)始分泌粘液時(shí)授粉，以24h為間隔連續(xù)授粉3次。自葡萄授粉后35d起，每隔10d調(diào)查1次胚珠發(fā)育狀況，即隨機(jī)取15粒果實(shí)，稱其漿果單粒重，然后剝開(kāi)果實(shí)取出胚珠，稱取胚珠的平均重量并統(tǒng)計(jì)漿果內(nèi)平均胚珠數(shù)，連續(xù)取樣3次，將取樣果粒在自來(lái)水中洗凈后，置于超凈工作臺(tái)上，先用75%的酒精浸泡45s，無(wú)菌水沖洗1次，再在3%的次氯酸鈉溶液中浸泡3min，無(wú)菌水沖洗3次。切開(kāi)漿果，取出胚珠，接種在培養(yǎng)基上。

1.2.1 雜交果實(shí)胚珠重量、胚珠數(shù)量變化觀察

取玫瑰香×戶太8號(hào)、玫瑰香×巨峰葡萄授粉后35、45、55d的果粒，每個(gè)取樣時(shí)期隨機(jī)選取15粒果實(shí)，稱其漿果單粒重，然后剝開(kāi)果實(shí)取出胚珠，稱取胚珠的平均重量并統(tǒng)計(jì)漿果內(nèi)平均胚珠數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。

1.2.2 不同接種時(shí)間對(duì)胚發(fā)育的影響

取玫瑰香×戶太8號(hào)、玫瑰香×巨峰葡萄授粉后35、45、55d的雜交胚珠在胚珠發(fā)育培養(yǎng)基上培養(yǎng)60d后進(jìn)行剝胚處理，調(diào)查胚發(fā)育的情況，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。

1.2.3 不同培養(yǎng)方式對(duì)幼胚萌發(fā)率的影響

分別取授粉后45d和55d玫瑰香×戶太8號(hào)、玫瑰香×巨峰雜交胚珠在發(fā)育培養(yǎng)基上培養(yǎng)60d后，分別進(jìn)行剝胚和剪喙處理，轉(zhuǎn)入胚萌發(fā)培養(yǎng)基，并統(tǒng)計(jì)胚萌發(fā)率、成苗率以及畸形苗率。

胚珠培養(yǎng)采用的ER培養(yǎng)基（0.5mg/L 6-BA，30g/L蔗糖，1g/L活性炭，pH5.8，5g/L瓊脂）。胚萌發(fā)過(guò)程中采用剝胚和剪喙兩種處理方法，在WPM培養(yǎng)基（0.2mg/L6-BA，30g/L蔗糖，1g/L活性炭，5g/L瓊脂，pH5.8）上培養(yǎng)，30d后調(diào)查胚成苗情況。

分別統(tǒng)計(jì)接種胚珠數(shù)、胚發(fā)育率、胚萌發(fā)率、胚成苗率和畸形苗率，計(jì)算方法如下：

胚發(fā)育率=（發(fā)育胚數(shù)/接種胚珠數(shù)）×100%；胚萌發(fā)率=（萌發(fā)胚數(shù)/接種胚珠數(shù)）×100%；成苗率為=（正常苗數(shù)/萌發(fā)胚數(shù)）×100%；畸形苗率（畸形苗數(shù)/萌發(fā)胚數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交果實(shí)胚珠重量、胚珠數(shù)量變化觀察

由表1可以看出：在授粉后35～55d，隨著取樣時(shí)間延遲，玫瑰香×戶太8號(hào)雜交果實(shí)平均重量持續(xù)增加，而雜交胚珠平均重量則呈先減后增趨勢(shì)，單粒漿果內(nèi)平均胚珠數(shù)逐漸減少。玫瑰香×巨峰雜交果實(shí)平均重量先增后減，雜交胚珠重則呈先減后增趨勢(shì)，單粒漿果內(nèi)平均胚珠數(shù)逐漸減少。

表1 不同接種時(shí)期果實(shí)重、胚珠重及胚珠數(shù)的觀察

2.2 不同接種時(shí)間對(duì)胚發(fā)育的影響

由表2可以看出：隨取樣時(shí)間的延遲，玫瑰香×戶太8號(hào)、玫瑰香×巨峰胚珠內(nèi)胚發(fā)育率總體呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，在授粉后55d胚發(fā)育率均達(dá)到最高；在授粉后45～55d，兩個(gè)雜交組合胚珠內(nèi)胚發(fā)育率呈明顯上升趨勢(shì)。在相同的采樣時(shí)間，玫瑰香×戶太8號(hào)胚發(fā)育率均高于玫瑰香×巨峰，不同的父本基因型對(duì)胚發(fā)育率也有一定的影響。

表2 不同取樣時(shí)期對(duì)胚發(fā)育率的影響

2.3 不同培養(yǎng)方式對(duì)幼胚萌發(fā)率的影響

由表3可以看出：不同取樣時(shí)間，玫瑰香×戶太8號(hào)胚珠內(nèi)胚萌發(fā)率剝胚處理高于剪喙處理，而玫瑰香×巨峰胚珠內(nèi)胚萌發(fā)率剝胚處理低于剪喙處理；兩個(gè)雜交組合的成苗率剪喙處理均高于剝胚處理，畸形苗率則是剝胚處理均高于剪喙處理；隨著取樣時(shí)期推遲，兩個(gè)雜交組合的剝胚處理胚萌發(fā)率、成苗率均上升，畸形苗率下降；玫瑰香×戶太8號(hào)剪喙處理胚萌發(fā)率、成苗率先升高后降低，玫瑰香×巨峰胚萌發(fā)率升高，成苗率則先升高后降低；在胚挽救過(guò)程中，兩個(gè)雜交組合，采取剪喙處理雜交胚更容易獲得正常苗，因此剪喙為較好的處理方式；玫瑰香×戶太8號(hào)和玫瑰香×巨峰在授粉后45d經(jīng)剪喙處理更容易獲得正常苗，因此授粉后45d為較好的取樣時(shí)期。

表3 不同處理方法對(duì)胚萌發(fā)胚成苗的影響

3 討論與結(jié)論

確定胚珠接種的最佳時(shí)間是胚挽救成功的前提。關(guān)于葡萄二倍體與四倍體的取樣時(shí)間，Yamashita等[2-3]和Okamoto等[4]報(bào)道的時(shí)間基本集中在授粉后50～70d。徐海英等[5]研究表明葡萄二倍體與四倍體雜交胚發(fā)育進(jìn)程與無(wú)核品種有顯著不同，同一品種內(nèi)存在果粒大小不整齊及同一果實(shí)中胚珠發(fā)育程度不一致現(xiàn)象，根據(jù)胚珠重量繪出的胚珠生長(zhǎng)曲線有些表現(xiàn)呈無(wú)規(guī)則，葡萄二倍體與四倍體雜交胚珠敗育是漸進(jìn)性的，發(fā)生敗育的時(shí)間與母本成熟期有明顯的關(guān)系，不同倍性的有核品種間雜交胚珠的敗育存在明顯的個(gè)體間差異。本研究中兩個(gè)雜交組合果實(shí)重和胚珠重表現(xiàn)有些無(wú)規(guī)則，而從胚珠數(shù)呈持續(xù)降低趨勢(shì)可以看出，在授粉后35d起，兩組雜交組合胚珠敗育逐漸增強(qiáng)。

葡萄的外種皮對(duì)于發(fā)育不完全胚存在著機(jī)械阻礙[6]，影響胚的萌發(fā)。眾多研究學(xué)者認(rèn)為，對(duì)葡萄珠被進(jìn)行一定的處理，可以提高無(wú)核葡萄胚的萌發(fā)及成苗率。Fernandez[7]對(duì)無(wú)核與無(wú)核雜交胚珠分別采用了3種珠被處理方式，直接進(jìn)行胚珠培養(yǎng)獲得幼苗，對(duì)于胚珠進(jìn)行切喙處理，剝?nèi)÷闩哌M(jìn)行胚萌發(fā)培養(yǎng)。結(jié)果顯示：剝?nèi)÷闩呙劝l(fā)率顯著高于其他兩種處理，最高可達(dá)67%。而經(jīng)過(guò)切喙和胚珠直接培養(yǎng)胚萌發(fā)率僅為0～15%，E－mershad[8]、Ramming[9]、Spigel-Rol[10]、Cain[11]等采用胚珠培養(yǎng)再剝?nèi)÷闩吲囵B(yǎng)來(lái)提高無(wú)核葡萄的胚挽救成功率。郭印山等[12]對(duì)二倍體與四倍體葡萄雜種胚珠采取橫切的方法獲得了三倍體植株，郭海江、王躍進(jìn)等[13]采取剝?nèi)÷闩叩姆椒ǐ@得了大量的雜種后代。孟新法等[14]研究發(fā)現(xiàn)剝?nèi)÷闩?，可以使胚萌發(fā)提前，萌發(fā)整齊，提高成苗質(zhì)量，并且能直接判斷最后的成苗是合子胚還是體細(xì)胞胚。蔣愛(ài)麗等[15]研究認(rèn)為：盡管采取剝胚得到的有胚率為最高，但是由于操作中易碰傷及其他原因，畸形苗占相當(dāng)比例，所得正常的試管苗比不剝胚的還略低些。

本研究以玫瑰香×戶太8號(hào)、玫瑰香×巨峰雜交胚珠為試材，研究發(fā)現(xiàn)兩組雜交組合授粉后35d起，胚珠敗育逐漸增強(qiáng)，在授粉后55d取樣，胚發(fā)育率最高；經(jīng)剪喙處理過(guò)的雜交胚珠成苗率高且畸形苗率低。在胚挽救過(guò)程中，兩個(gè)雜交組合，采取剪喙處理雜交胚更容易獲得正常苗，因此剪喙為較好的處理方式；玫瑰香×戶太8號(hào)和玫瑰香×巨峰，在授粉后45d經(jīng)剪喙處理更容易獲得正常苗，因此授粉后45d為較好的取樣時(shí)期。

［1］Ramming D W，Emershad R L.In-ovule embryo culture of seeded and seedless［J］.V.vinifera L.Horticultural Science，1982，17（3）：487.

［2］Yamashita H，Haniuda T，Shiba H.In vitro culture of embryos obtained by crossing tetraploid grape cultivar‘Kyoho’ with diploid cultivars ［J］.Journalofthe Japanese Society for Horticultral Science，1995，63（4）：719-724.

［3］Yamashita H，Horiuchi S，Taira T.Development of seeds and growth of triploid seedlings obtained from reciprocalcrossesbetween diploidsand tetraploids grapes［J］.Journal of the Japanese Society for Horticultral Science，1993，62（2）：249-255.

［4］Okamoto G，Hirano K，Tanakamaru N，Omori N.Obtaining triploid muscatgrapesby in vitro culture of ovulesand embryosafter crossing between diploid and tetraploid cultivars［J］.Scientific Reports of the Faculty of Agriculture ，Okayama University，1993，82：25-29.

［5］徐海英，閆愛(ài)玲，張國(guó)軍.葡萄二倍體與四倍體品種間雜交胚挽救取樣時(shí)期的確定［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（3）：629-633.

［6］劉佳，劉曉，陳建，等.金星無(wú)核葡萄胚挽救影響因素的研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，26（1）：294-298.

［7］Fernandaz，J.N.MOORE.Effect of seedcoat manipulation on the germination ofstenospermocarpic grape embryos cultured in ovule［J］.Hortscience.1991，26（9）：1220.

［8］EmershadR.L.，RammingD.W.，SerpeM.D..Inovule embryo development and plant formation from stenospermic genotypes of vitis vinifera ［J］.Amer.J.Bot.，1989，76（3）：397-402.

［9］Ramming D.W.，Lu J.，Lamikanra O.，et al.Developing seedless grapes by embryo rescue［J］.Proc Vitis Symp.1995，18：26-30.

［10］Spiegle-Roy，Sahar P N，Baron J，et a1..In vitro culture and plant formation from grape cultivars with abortic ovules and Seeds［J］..Amer Soc.-Hort.-Sci..1985，110：109-112.

［11］Cain D.W.，Emershad R.L.，Tarilo R.E..In-ovule embryo culture and see dlingdevelopmentofseeded and seedless grapes（V.vinifera L.）［J］.Vitis.1983，22：9-14.

［12］郭印山，陳文玲，郭修武，等.二倍體與四倍體葡萄品種雜交胚挽救及后代倍性鑒定［J］.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，（3） .

［13］郭海江，王躍進(jìn)，張劍俠.葡萄抗病無(wú)核胚挽救育種及分子標(biāo)記輔助選擇［J］. 西北植物學(xué)報(bào)，2005，（12）：2395-2401.

［14］孟新法，張利，張潞生，等.無(wú)核葡萄胚發(fā)育及早期離體培養(yǎng)的研究：III.接種方式對(duì)離體胚發(fā)育的影響［J］.北京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1992，18（4）：393-395.

［15］蔣愛(ài)麗，李世誠(chéng)，金佩芳，等.大敗育型無(wú)核葡萄胚珠培養(yǎng)成苗技術(shù)研究［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2002，20（1）：45-48.