王惠君 ，盧 誠 ，黎 明 ，陳 友

（1.瓊州學院商學院，海南 三亞 572022；2.中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所，海南 ?？?571101）

早在90年代石健泉[1]、熊子成[2]對廣西黃皮種質資源進行過調查，之后的20a間對黃皮的研究大都在黃皮果的營養(yǎng)價值[3]、化學成分[4-5]、栽培技術[6-7]、開發(fā)利用[8]等方面。隨著當代社會快速發(fā)展，原有的優(yōu)良黃皮種質資源不能滿足于市場的需求，迫切需要對原有優(yōu)良黃皮品質進行改良，尤其是黃皮果果品品質的儲運方面缺陷成為黃皮產業(yè)的瓶頸，同時廣西各地黃皮資源的質量性狀參差不齊[9-12]，且果實口味各不相同，黃皮原材料將很難大規(guī)模開發(fā)利用。利用分子輔助育種方法用于發(fā)掘優(yōu)良品質資源或改良有部分缺陷的優(yōu)良資源在現代栽培種植中就顯得具有緊迫性。分子遺傳多樣性方面的研究比較薄弱，綜合比較各類分子標記的優(yōu)勢，本研究選用操作簡便具有較好的重復性且多態(tài)性較為豐富的ISSR[13-16]標記技術做黃皮親緣關系和遺傳多樣性分析，為今后的品種選育和分子輔助改良育種提供一定的分類依據。

1 材料與方法

1.1 材料

24份黃皮種質，如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 ISSR-PCR擴增反應體系的建立

基因組DNA采用實驗室成熟的方法改良CTAB法[17]提取，通過正交實驗方法對ISSR-PCR擴增反應進行優(yōu)化后建立20μL反應體系，其中ISSR引物為UBC公布的序列[14]。反應體系如下：Taq酶量1.5U，DNA模板為50ng，引物濃度為 0.5μmol/L，dNTPs濃度為 0.3mmol/L，Mg2+濃度為2.0mmol/L，最后用超純水補充至20μL。擴增反應程序如下設置：預變性溫度/時間-94℃/5min；變性溫度/時間-94℃/35s；退火溫度/時間-50℃/60s；延伸溫度/時間-72℃/90s，37 個循環(huán)，最后延伸-72℃（10min），擴增產物將貯存于4℃條件下。

表1 24份黃皮種質信息

1.2.2 數據的分析和處理

呈現為顯性標記的ISSR分子標記，在數據分析時根據該分子標記特點的遷移率及有無來統(tǒng)計，無條帶統(tǒng)計為0，有條帶統(tǒng)計為1，強、弱條帶均統(tǒng)計為1，將數據以“0，1”輸入Excle 2003文檔中構建矩陣數據，統(tǒng)計出總帶數、多態(tài)性條帶數、各引物多態(tài)性比率。用生物學NTEDIT軟件將該矩陣數據轉換為可用于聚類分析軟件NTSYS-PC分析的NTS矩陣數據格式，然后將計算得出的遺傳相似系數數據按照UPGMA方法進行聚類分析，繪制出該物種的樹狀聚類圖。

2 結果與分析

2.1 多態(tài)性分析

該實驗從96個引物中，篩選出18個多態(tài)性豐富、重復性好的ISSR引物對所收集的24份黃皮優(yōu)質種質資源的基因組DNA進行多態(tài)性檢測。結果如下：共擴增出的條帶172條，其中多態(tài)性條帶105條，多態(tài)性比率為61.0%。各引物平均能夠擴增出9.56條多態(tài)性條帶，擴增位點最少的引物是GXHP-8，其位點數為6，其中擴增位點最多的引物是GXHP-6，其位點數為17。實驗表明所供黃皮實驗材料多態(tài)性豐富。18條ISSR引物產生的多態(tài)性條帶詳見表2、圖 1。

表2 18條ISSR-PCR引物擴增結果

圖1 GXHP-3引物對24份優(yōu)質黃皮品種ISSR-PCR擴增結果

2.2 聚類分析

通過所選ISSR-PCR引物組合擴增所得到的帶紋結果進行統(tǒng)計后轉換并獲得172個標記的矩陣數據。將用構建的矩陣數據導入NTSYS-PC軟件計算得到24份黃皮優(yōu)良品種種質材料相關的遺傳相似系數（GS）詳情見表3。參照UPGMA聚類分析方法計算出所測定材料的親緣關系圖譜（如圖2所示）。24份優(yōu)質黃皮品種間的遺傳相似系數取值范圍在0.660～1.000區(qū)間。南寧無核（1）、欽州無核（12）、玉林無核（7）、防城港無核（24）、河池無核（18）品種間相似度較高，遺傳相似系數在0.961以上。其中欽州無核（12）和南寧無核（1）之間的遺傳相似系數為1.000。山黃皮品種與其他品種間的遺傳相似性系數最小為0.660。以上數據可以說明，所搜集的24份優(yōu)質黃皮種質之間的親緣關系除了山黃皮外其他各品種的親緣關系相對較近。當遺傳相似系數為0.718時將黃皮優(yōu)質品種資源分為3個大的群體，各個大的群體又包含不同的品種。其中第I大群體包括了4品種，由獨核、無核、水晶、牛奶組成；在第II大群體里由大圓頭、卵形、雞心形3個品種。在第III群僅有山黃皮1個品種。

3 討論

在I群體中包含獨核、無核、水晶、牛奶4個品種。在遺傳相似系數為0.96時，來源于5個不同地方的無核黃皮聚合在一起，其中來源于欽州無核和南寧無核黃皮GS系數為1.000。欽州無核在廣西栽培最多，極有可能南寧無核是從欽州引種的。當遺傳相似系數為0.931時，無核與獨核品種聚合在一起，說明這兩個品種遺傳背景較為相似，間接說明無核很有可能是獨核的一個變種。要想確定這兩個品種的具體關系還要做進一步的研究。當遺傳相似系數為0.828時獨核和無核與水晶聚合在一起，說明獨核、無核與水晶的遺傳背景較近；當遺傳相似系數為0.795時，獨核、無核、水晶與牛奶聚合在一起。其中同一品種牛奶黃皮品種由于來源不同，遺傳相似系數較遠，很有可能是由地域阻隔等外界因素的影響對遺傳背景產生的變異。在II群體中包含有大圓頭、卵形和雞心黃皮3個品種。雖然有地域上的差異，但是從整體上看都是以相同品種的黃皮首先聚合在一起。其中只有一個雞心黃皮品種有交叉，在遺傳相似性系數為0.836時河池雞心（20）與卵形、大圓頭黃皮聚合在一起，當遺傳系數為0.782時河池雞心（20）、卵形、大圓頭與南寧雞心（5）和玉林雞心（10）聚合在一起。在進化地位上推斷，很有可能卵形和大圓頭是由雞心品種進化而來。要想明確具體進化情況要做進一步的研究。在III群只有山黃皮一個品種，在南寧山黃皮（6）和梧州山黃皮（18）遺傳相似系數在0.893時才聚合，同時也可以說明由于山黃皮屬于小眾水果，有的山黃皮資源屬于半野生狀態(tài)，由于地域的阻隔，遺傳基因交流也相對較少。山黃皮與黃皮屬于同一個屬但不同種，在聚類分析的數據結果中山黃皮與其他各類黃皮的遺傳相似性系數為0.660，相似性相對較小，這一結果與傳統(tǒng)的形態(tài)學標記分類相吻合，也為山黃皮與黃皮的親緣關系提供了科學的技術支持。由于山黃皮與黃皮的遺傳的差異性相對較大，因而山黃皮可以作為優(yōu)質黃皮品種改良的潛在基因庫。

表3 24份黃皮優(yōu)質品種種質間遺傳相似性數據

圖2 基于ISSR標記的24份品種材料的UPGAME聚類分析圖譜

品種遺傳改良的各種方法中，作為最為原始的人工雜交方法是最為有效的。如果遺傳背景較為復雜的條件下，憑借傳統(tǒng)的方法如形態(tài)學標記、生化標記、細胞標記等方法還余存較多的爭議，無法判斷兩兩品種之間的遺傳背景現狀。因而傳統(tǒng)遺傳改良育種方法帶有盲目性。為了解各個品種之間的親緣關系，我們可以采取分子標記的方法，快速的對所提供的優(yōu)良品種在分子水平進行分析各品種之間的親緣關系。利用親緣關系較遠的品種間進行遺傳改良育種，為今后更有目標、有預見的引種和育種，進而縮短育種年限和提高育種效率提供理論依據，同時也可為所研究品種間的親緣關系和進化地位提供佐證。在此試驗中選擇的廣西各地主要推廣的8個優(yōu)質黃皮品種種質資源進行分析，從所得的聚類分析結果上與傳統(tǒng)的形態(tài)學分類方法大致相同。

4 結論

在96個的ISSR-PCR引物中篩選出18個具有重復性和多態(tài)性較好引物，對24份優(yōu)質推廣黃皮品種種質資源材料進行ISSR分子標記技術分析，共獲得172個位點，其中的105個是具有多態(tài)性的，多態(tài)性比率為61.0%。在遺傳相似性系數為0.718時將24份黃皮品種種質資源分為3個大群。該試驗結果不僅在黃皮形態(tài)學上分類鑒定提供了佐證，也為優(yōu)質黃皮品種間的親緣關系給予初步鑒定，為優(yōu)質黃皮品種種質資源的開發(fā)研究領域提供新的方法。

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