羅宏成，　王春芳，　向　陽，　雷　茗，　鄧　鷹，　韋葉生（.暨南大學(xué)　附屬第一醫(yī)院　臨床檢驗(yàn)中心，廣東　廣州　50630；.右江民族醫(yī)學(xué)院　附屬醫(yī)院　檢驗(yàn)科，廣西　百色　533000）

廣西百色市胎兒羊水地中海貧血基因檢測分析

羅宏成1，王春芳2，向陽2，雷茗2，鄧鷹2，韋葉生2
（1.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，廣東廣州510630；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西百色533000）

目的：運(yùn)用分子雜交和基因芯片技術(shù)對(duì)百色市地中海貧血（簡稱“地貧”）孕婦進(jìn)行羊水地貧基因檢測，了解地貧胎兒的發(fā)病率及基因突變類型.方法：采用跨躍斷裂點(diǎn)聚合酶鏈反應(yīng)（gap-PCR）及膜－反向點(diǎn)雜交技術(shù)檢測中國人常見的缺失型α-地中海貧血、突變型α-地中海貧血及β-地中海貧血.結(jié)果：檢出單純性α-地中海貧血145例（47.3%），中、重型α-地中海貧血52（36.2%），重型Barts水腫胎兒16例（11.3%），中型血紅蛋白H?。℉bH）病36例（24.8%）；單純性 β-地中海貧血103例（33.6%），β-地中海貧血中重型28例（27.2%）；復(fù)合型 αβ地中海貧血21例（6.8%）；壯族人群α-地中海貧血發(fā)生率為56.6%，瑤族人群α-地中海貧血發(fā)生率為27.6%，漢族人群檢出α-地中海貧血發(fā)生率為15.8%；壯族人群β-地中海貧血發(fā)生率為66.0%，瑤族人群β-地中海貧血發(fā)生率為21.4%，漢族人群β-地中海貧血發(fā)生率為12.6%.結(jié)論：百色地區(qū)胎兒羊水地貧基因檢測陽性率較高，特別是中重型地中海貧血類型胎兒陽性率也很高；壯、瑤、漢各民族α-地中海貧血的發(fā)病率具有顯著性差異（P＜0.05），壯、瑤、漢各民族β-地中海貧血的發(fā)病率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）.對(duì)該地區(qū)孕育胎兒的夫婦應(yīng)該進(jìn)行產(chǎn)前地中海貧血基因篩查及孕育知識(shí)的長期指導(dǎo).

地中海貧血；羊水；基因型分析

地中海貧血（簡稱“地貧”）是世界上最常見的遺傳性疾病，主要是由合成血紅蛋白的珠蛋白肽鏈合成不足或缺少而引起的溶血性貧血.廣西是中間型及重型地中海貧血患兒出生的高發(fā)區(qū)［1］.百色地區(qū)是廣西經(jīng)濟(jì)發(fā)展比較落后的地區(qū)，高危地貧胎兒診斷達(dá)到29.6%［2］，給家庭和社會(huì)造成巨大的精神負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)壓力.有效地開展胎兒羊水地中海貧血基因檢測，了解孕育胎兒的地貧類型及基因型，對(duì)指導(dǎo)健康胎兒的出生及避免中重型高危地貧小孩的出生具有重大作用.

1　材料與方法

1.1標(biāo)本

為2011年5月至2017年5月在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心行羊水穿刺地貧基因檢測的來自百色市11個(gè)縣的孕婦共307例，其中壯族197例；瑤族53例；漢族36例；仫佬族15例；苗族6例；彝族3例.主要由婦產(chǎn)科醫(yī)生在B超指引下抽取16至21周期間胎兒羊水10 mL.避免羊水標(biāo)本母體血液污染方法；在最佳羊水穿刺時(shí)間16～20周，由資深經(jīng)驗(yàn)的婦產(chǎn)科醫(yī)生在超聲引導(dǎo)下，準(zhǔn)確迅速進(jìn)針達(dá)到穿刺深度，取出針芯，抽羊水者以小針筒抽取2 mL羊水丟棄以防母血污染，然后再換大針筒抽取羊水15～20 mL送檢，采集兩管各10 mL的羊水標(biāo)本盛于無菌管中，其中一管直接離心收集細(xì)胞提取DNA進(jìn)行檢測，另一無菌管置于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)環(huán)境條件下進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)后再提取DNA進(jìn)行檢測，根據(jù)培養(yǎng)前后基因型判斷有無母血污染.用深圳亞能公司DNA快速提取試劑盒提取羊水里的細(xì)胞DNA.

1.2試劑及儀器

相關(guān)檢測試劑均購自深圳亞能生物公司.儀器采用美國伯樂BIO-RAD S1000基因擴(kuò)增儀PCR儀、美國伯樂BIO-RAD Gel Doc-xr凝膠成像儀、江蘇興化市-FYY-5型分子雜交儀、eppendorf低溫高速離心機(jī)、珠海黑馬H1干式恒溫儀及2～1 000 μL eppen-dorf微量加樣器.

1.3檢測方法

（1）缺失型α-地中海貧血檢測方法應(yīng)用跨躍斷裂點(diǎn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（gap-PCR）的技術(shù)原理對(duì)3種常見缺失型αα/--SEA、αα/-α3.7、αα/-α4.2進(jìn)行檢測，再通過瓊脂糖凝膠電泳來判斷檢測樣品的基因型.PCR按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增：96℃5 min；［98 ℃ 45 sec 65℃ 90 sec 72℃ 3 min］10 cycles；［98 ℃ 30 sec 65℃45 sec 72℃3 min］25 cycles；72℃10 min.

（2）突變型α-地中海貧血檢測方法采用PCR和DNA反向點(diǎn)雜交（PCR-RDB）技術(shù)對(duì)中國人常見的三種突變QS、CS、WS進(jìn)行檢測.PCR按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增：50℃15 min；95℃10 min；［94℃1 min，55℃30 sec，72℃30 sec］35 cycles；72℃5 min.

（3）β-地中海貧血的檢測采用PCR和DNA反向點(diǎn)雜交（PCR-RDB）技術(shù)對(duì)中國人常見的突變位點(diǎn)CD17、CD41-42、-28，IVSI-1、βE進(jìn)行檢測.PCR按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增：50℃15 min；95℃10 min；［94℃1 min，55℃30 sec，72℃30 sec］35 cycles；72℃5 min

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.基因型和基因型頻率采用直接計(jì)算法，各民族間基因頻率比較采用多個(gè)樣本率比較的χ2檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2　結(jié)果

2.1地中海貧血羊水檢測結(jié)果

307例孕婦羊水地貧檢測中共有269例羊水地貧基因陽性，陽性率達(dá)87.6%，其中單純性α-地中海貧血145例（47.3%），單純性β-地中海貧血103例（33.6%），αβ復(fù)合型地中海貧血21例（6.8%）.

2.2陽性α-地中海貧血基因型檢測

陽性α-地中海貧血基因型檢測詳見表1.

表1　α-地中海貧血基因型檢測結(jié)果Table 1　The results of Alpha thalassaemia genotype test

2.3αβ復(fù)合型地中海貧血基因型檢測

αβ復(fù)合型地中海貧血基因型檢測詳見表2.

表2　αβ復(fù)合型地中海貧血基因型檢測結(jié)果Table 2　The results of Alpha and Beta thalassaemia geno-type test

2.4陽性β-地中海貧血基因型檢測

陽性β-地中海貧血基因型檢測詳見表3.

表3　β-地中海貧血基因型檢測Table 3　The results of Beta thalassaemia genotype test

2.5壯、瑤、漢族三個(gè)民族α-地中海貧血的發(fā)生率及基因型

307例受檢胎兒羊水中，僅統(tǒng)計(jì)占研究對(duì)象主體中壯、瑤、漢族三個(gè)民族人群發(fā)生率及基因型.其他民族人數(shù)及α-地中海貧血的例數(shù)少，未做統(tǒng)計(jì).

壯族人群中檢出α-地中海貧血82例，發(fā)生率為56.6%，基因型有11種.瑤族人群檢出α-地中海貧血40例，發(fā)生率為27.6%，基因型有6種.漢族人群檢出α-地中海貧血23例，發(fā)生率為15.8%，基因型有8種.經(jīng)多樣本率比較的X2檢驗(yàn)，壯、瑤、漢各民族α-地中海貧血的發(fā)病率具有顯著性差異（X2＝22.009，P＝0.000＜0.05），瑤族α-地中海貧血高于壯族和漢族.壯、瑤、漢各民族α-地中海貧血基因突變類型，見表4.

2.6壯、瑤、漢族三個(gè)民族β-地中海貧血的發(fā)生率及基因型

表4　壯、瑤、漢族各種α-地中海貧血基因型檢測結(jié)果1）Table 4　The result of genotype of Alpha thalassaemia in Zhuang、Yao and Han populations

307例受檢胎兒羊水中，僅統(tǒng)計(jì)占研究對(duì)象主體中壯、瑤、漢族三個(gè)民族人群發(fā)生率及基因型.其他民族人數(shù)及β-地中海貧血的例數(shù)少，未做統(tǒng)計(jì).

壯族人群中檢出β-地中海貧血68例，發(fā)生率為66.0%，基因型有17種.瑤族人群中檢出β-地中海貧血22例，發(fā)生率為21.4%，基因型有10種.漢族人群中β-地中海貧血13例，發(fā)生率為12.6%，基因型有7種.經(jīng)多樣本率比較的2檢驗(yàn)，壯、瑤、漢各民族β-地中海貧血的發(fā)病率無顯著性差異（2＝0.886，P＝0.642＞0.05）.壯、瑤、漢各民族α-地中海貧血基因突變類型見表5.

表5　壯、瑤、漢族胎兒羊水各種　β-地中海貧血基因型檢測結(jié)果1）Table 5　The result of genotype of Beta thalassaemia in Zhuang、Yao and Han populations

3　討論

地中海貧血又稱海洋性貧血，因最早在地中海、意大利、希臘等地區(qū)發(fā)現(xiàn)，故稱地中海貧血.據(jù)2008年世界血紅蛋白病流行病學(xué)報(bào)告，每年大約有56 000例重型β-地中海貧血，其中至少有30 000例需規(guī)范輸血才能存活，5 500例重型α-地中海貧血死于圍生期［3－4］.我國南方地區(qū)各地報(bào)道的地貧基因缺陷率為2.5%～20%，廣東及廣西兩省地貧基因缺陷發(fā)生率分別高達(dá)10%及20%，兩省地貧的病例數(shù)占全國總數(shù)的2/5以上［5］.目前，世界上對(duì)地貧的篩查與診斷主要運(yùn)用基因診斷，地貧的治療目前尚無特效療法，診斷和預(yù)防重型地貧胎兒的發(fā)生極其重要.百色地區(qū)是廣西地中海貧血的高發(fā)區(qū)，因此，本研究首次對(duì)各民族胎兒羊水基因型及基因頻率在百色地區(qū)的分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)地貧的篩查和孕育指導(dǎo)具有重大的意義，可以有效控制本地區(qū)高危人群中、重型地貧患兒的出生，從而可降低出生缺陷.

地中海貧血主要分為α-地中海貧血和β-地中海貧血兩種主要類型.α-地中海貧血主要由于合成α珠蛋白基因的缺失所致，少數(shù)由基因點(diǎn)突變?cè)斐?，中國南方常見缺失?α-地中海貧血有 αα/--SEA、αα/-α3.7、αα/-α4.2，常見突變型α-地中海貧血有αα/ααQS、αα/ααCS、αα/ααWS等［6］.β-地中海貧血主要由合成β珠蛋白的基因所突變?cè)斐傻?，中國南方常見的?地中海貧血主要有CD17、CD41-42M、IVSI-1、-28M、βE等［7］位點(diǎn)突變.地中海貧血按臨床病情主要分為輕型、中間型、重型，輕型地中海貧血出生后多無癥狀，中間型地中海貧血靠輸血可以活到成年，重型地中海貧血多數(shù)胎死腹中或出生后即死亡.地中海貧血是一種常見單基因遺傳病［8］，其基本特征是遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，疾病從父母傳至子女，其發(fā)病幾乎完全由遺傳因素決定.地中海貧血是常染色體隱性遺傳?。?］，只有在純合子時(shí)才發(fā)病，故基因攜帶者通常無生理異常，大部分地中海貧血基因攜帶者并不知道自己是攜帶者，常規(guī)檢查很難確定基因攜帶者，若夫妻雙方同為地貧基因攜帶者，則重型地中海貧血患兒出生的概率為25%［10］，地中海貧血也是一種嚴(yán)重的血液性疾?。?1］，目前尚無特效治療.因此，有效地開展地中海貧血基因的檢測，特別對(duì)于地貧高發(fā)區(qū)的婚育年齡的地貧基因攜帶夫婦進(jìn)行大規(guī)模的篩查是必要的預(yù)防措施，是降低地貧患兒出生率的有效措施，開展胎兒羊水地貧基因檢測是避免重型地貧小孩出生的最好方法.本研究結(jié)果所得百色地區(qū)α-地中海貧血發(fā)生率（47.3%），β-地中海貧血發(fā)生率（33.6%），復(fù)合型αβ地中海貧血發(fā)生率（6.8%），與陳秋莉等［12］研究相近，所檢測出的中型地中海貧血血紅蛋白H?。℉BH）（24.8%），比同為地貧高發(fā)區(qū)的廣東惠州高，重型地中海貧血Barts（11.3%）胎兒水腫，比何麗等［13］報(bào)道惠州地區(qū)相一致.所檢測出的β-地中海貧血中重型（27.2%）比例相對(duì)高，重型β-地中海貧血比何麗等［14］報(bào)道相對(duì)低，是因?yàn)楸敬窝芯繉?duì)象為地中海貧血夫妻雙方為地貧基因攜帶者或其中一方為攜帶者都納入本次實(shí)驗(yàn)中.

綜上所述，本次研究對(duì)百色地區(qū)胎兒羊水地貧基因的發(fā)病率及突變類型有一定的了解，為本地區(qū)產(chǎn)前診斷的篩查提供了一些基本的方向.本實(shí)驗(yàn)沒能分析夫妻雙方的基因型及其的遺傳規(guī)律，這項(xiàng)研究有待具體的遺傳信息學(xué)系統(tǒng)分析，也是今后本課題的努力研究方向.

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［14］朱曉潔，劉宇鵬，劉瑞玉.惠州市同型β地中海貧血夫婦的胎兒產(chǎn)前地貧基因診斷分析［J］.中國兒童保健雜志，2015，23（8）：1.

［責(zé)任編輯：陳詠梅］

Detection and analysis of thalassemia gene of the fetal amniotic fluid in baise city

LUO Hongcheng1，WANG Chunfang2，XIANG Yang2，LEI Ming2，DENG Ying2，WEI Yesheng2
（1.Department of Laboratory Center，the First Affiliated Hospital，Jinan University，Guangzhou 510630，China；2.Department of Laboratory Center，Affilated Hospital of You Jiang Medical College for Nationalities，Baise，533000，China）

Aim：Using the molecular hybridization and gene chip technology to detect the thalassemia gene of pregnant women with thalassemia in Baise city，to learn the incidence and mutation types of the Fetal with thalassemia.Methods：Using the gap Polymerase Chain Reaction（gap-PCR）and membrane-reverse dot hybridization technique to detect the lack of Chinese common type of alpha thalassaemia，the mutant of alpha thalassaemia and beta thalassaemia.Results：One hundred and forty-five cases were di-agnosed with simple alpha thalassaemia which accout For 47.3%，the Medium and heavy of alpha thalas-saemia accout for 36.2%，and 16 case of Hb Barts hydrops fetalis tire having heavy alpha thalassaemia accout for 11.3%，36 cases were diagnosed with HbH disease which accout for 24.8%；145 cases were diagnosed with simple Beta thalassaemia which accout for 33.6%，and the Medium and heavy of Beta thalassaemia accout for 27.2%；21 cases were diagnosed with the Compound of alpha and beta thalassae-miawhich accout for 6.8%；The incidence of alpha thalassaemia in Zhuang populations was 56.6%，27.6%in Yao populations，and 15.8%in Han populations；The incidence of Beta thalassaemia in Zhuang populations was 66.0%，21.4%in Yao populations，and 12.6%in Han populations.Conclu-sion：The positivty of fetal amniotic fluid with thalassemia is higher in Baise city.Especially，the positive rate of Medium and heavy of fetal is also high；The incidence of alpha thalassaemia was significant differ-ence in Zhuang，Yao，Han Populations（P＜0.05），The incidence of beta thalassaemia was no statistical difference in Zhuang，Yao，Han Populations（P＞0.05）.Couples who will give birth to baby in the re-gion should make prenatal genetic of thalassemia screening and breeding knowledge guide.

thalassemia；amniotic fluid；genotype analysis

R715.5

A

1000－9965（2015）06－0520－05

10.11778/j.jdxb.2015.06.014

2015－08－11

廣西百色市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目［百科計(jì)字（201204）1號(hào)］

羅宏成（1985－），男，檢驗(yàn)師，研究方向：地中海貧血分子生物學(xué)

韋葉生，教授，Tel：0776－2853093，E-mail：wysh22＠163.com