單幼蘭，　江培學（.重慶醫(yī)科大學　附屬第二醫(yī)院　肝病實驗室，重慶　400038；.復旦大學　附屬華山醫(yī)院　感染科，上?！?033）

連接酶檢測反應技術應用于乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥和阿德福韋耐藥突變的研究

單幼蘭1，江培學2
（1.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院肝病實驗室，重慶400038；2.復旦大學附屬華山醫(yī)院感染科，上海200233）

目的：研究高溫連接酶檢測反應技術（LDR）技術檢測乙肝病毒拉米夫定耐藥和阿德福韋耐藥突變的可行性.方法：應用LDR技術和多聚酶鏈式反應（PCR）技術，在乙肝病毒基因相關區(qū)域設計引物和探針檢測突變位點.結(jié)果：該方法能很好的區(qū)分野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒；90例臨床樣本的測序結(jié)果與LDR檢測結(jié)果基本一致.結(jié)論：LDR技術可以應用于臨床乙肝病毒樣本的拉米夫定耐藥和阿德福韋耐藥的檢測.

乙肝病毒；拉米夫定；阿德福韋；耐藥突變

據(jù)估計，全球有3.5億人患有慢性乙肝，2006年全國人群乙肝等有關疾病血清流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，中國人群乙肝表面抗原攜帶率為7.18%，大概有9 300萬的乙肝感染者.2011年病毒性肝炎HBV（Hepatitis B Virus）報告發(fā)病例數(shù)中乙肝占到80%［1－4］.HBV的反復感染，可能導致慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌，積極的抗病毒治療可以有效提高患者的生存質(zhì)量.拉米夫定（Lamivudine，LMD）是迄今我國用于乙型肝炎治療的主要首選藥物之一；阿德福韋酯（Adefovir，ADV）是新一代抗乙型肝炎病毒新藥，可以有效抑制HBV在肝細胞內(nèi)的復制.然而，隨著臨床服藥時間的延長，拉米夫定與阿德福韋酯的耐藥率會顯著提高.常見的拉米夫定耐藥位點是L180M和M204I/V（YIDD/YVDD）；常見的阿德福韋耐藥位點是A181V/T和N236T.因此臨床上急需一種靈敏性高、特異性好的方法檢測拉米夫定與阿德福韋酯耐藥［5－7］.本研究建立了一種基于連接酶檢測反應技術的拉米夫定與阿德福韋酯耐藥突變檢測方案，將為臨床HBV耐藥的診斷提供實驗依據(jù).

1　資料與方法

1.1資料與材料

（1）病例資料收集2009年至2012年在重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院進行抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者樣本180例，其中90例患者服用拉米夫定治療2年、90例患者用阿德福韋治療3年.男97例，女83例，年齡39～58歲；HBeAg（e抗原）陽性患者145例，抗HBeAg陽性35例，平均丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平為（79.8±53.1）IU/L，平均HBV DNA水平（log10拷貝數(shù)/mL）為5.75.上述研究病例獲得醫(yī)院倫理委員會批準；相關患者都簽署了知情同意書.本研究中慢性乙型肝炎特征為：乙型肝炎表面抗原陽性，且至少6個月；血清HBV DNA＞10 000 IU/mL；ALT水平升高或反復升高.患者血清分離后－70℃保存?zhèn)溆?

（2）儀器及試劑熒光定量PCR儀為Life Technology公司ABI7500，HBV DNA定量試劑盒和HBV cccDNA定量試劑盒均購自上海星耀醫(yī)學科技發(fā)展有限公司（復星診斷）.MJ-90 PCR購自美國伯樂公司，ABI3130測序儀購自美國ABI公司.

1.2方法

（1）HBV DNA定量檢測采用ABI7500實時熒光定量PCR儀檢測，試劑由上海星耀醫(yī)學科技發(fā)展有限公司提供.按照HBV DNA定量試劑盒說明書進行.取血清100 μL加入等量DNA提取液A，混勻后143 00 g離心10 min，去除上清后加50μL DNA提取液B，混勻后100℃煮沸10 min，離心后取上清即為總HBV DNA.提取產(chǎn)物做實時熒光多聚酶鏈式反應（ploymerase chain reaction，PCR），由標準曲線計算出HBV DNA的定量濃度值.

（3）連接酶方法的引物和探針引物探針堿基序列及表度（表1）.

表1　引物探針序列Table 1　Primers and Probes

（3）測序方法的引物和探針測序的引物提供給Invitrogen司合成并完成測序，測序引物如下：

5′-CATTTGTTCAGTGGTTCGTA-3′；

5′-CAAAAGAAAATTGGTAACAGCGGTA-3′

PCR條件為：94℃ 4 min，30個循環(huán)94℃ 10 sec；60℃45 sec；72℃ 1 min.PCR產(chǎn)物送Invitrogen做測序，測序結(jié)果在NCBI上分析比對.

（4）PCR擴增PCR擴增體系包括濃度為10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris），HCl（pH＝8.3）、濃度分別為50 mmol/L KCl、2.0 nmol/L MgCl2、200 tx mol/L dNTP、300 nmol/L引物、1.5 U熱啟動Taq酶、5 μL DNA模板，總反應體積為50 L.反應條件為：首先在95℃反應10 min以激活熱啟動酶，然后95℃ 30 s，54℃ 50 s，72℃ 60 s，擴增35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min.

（5）LDR檢測LDR緩沖溶液中加入2 μL PCR產(chǎn)物、濃度為0.1 mmol/L DNA連接酶，總反應體積為20 μL.反應條件為：95℃2 min，然后95℃15 s，50℃20 s，循環(huán)3O次.擴增完成后加入0.5 μL濃度為0.5 mmol/L的EDTA使反應終止.取2.5 μL反應產(chǎn)物與等體積上樣緩沖液混合，然后在94℃變性2 min，迅速在冰上冷卻，立即加入ABI Prism 3130測序儀變性凝膠進行電泳30 min.

1.3統(tǒng)計學方法

電泳結(jié)果采用Genemapper 4.0軟件進行分析.

2　結(jié)果

2.1對照質(zhì)粒檢測結(jié)果

首先對含有HBV rtA181位點突變型及野生型的質(zhì)粒分別進行檢測，每個反應重復3次，均得到預期的檢測結(jié)果，與野生型質(zhì)粒沒有交叉擴增.

將含有是L180M、M204I/V、A181V/T和N236T的質(zhì)粒分別稀釋成106、105、104、103及102拷貝/mL進行檢測，每個檢測反應重復3次.其中10拷貝/mL以上的質(zhì)粒均能穩(wěn)定地檢出突變，但102拷貝/mL的質(zhì)粒則至少有1次未能有檢測結(jié)果，因此可以認為本方法檢測的敏感性為103拷貝/mL.以甲型肝炎病毒（HAV）RNA、丙型肝炎病毒（HCV）RNA及人巨細胞?。℉CMV）DNA為模板進行檢測，未檢測到陽性信號.

圖1　181突變型質(zhì)粒Fig.1　181mutation-type plasmid

圖2　236突變型質(zhì)粒Fig.2　236 mutation-type plasmid

2.2臨床樣本LDR檢測

90例拉米夫定治療的臨床樣本中LDR共檢出43例突變樣本，其中YIDD（204I）14例YVDD （204V）23例，L180M6例，其中又包括YIDD和L180M變異3例；YIDD和L180M變異4例；YIDD 和YMDD變異5例.90例阿德福韋治療的臨床樣本中LDR共檢出8例突變樣本，其中A181V/T4例，N236T3例，A181V/T和N236T變異1例.

圖3　YIDD變異和A181V/T變異Fig.3　YIDD mutation and A181V/T mutation

圖4　A181V/T變異和N236T變異Fig.4　A181V/T mutation and N236T mutation

2.3Sanger法測序驗證

LDR-PCR法對90例拉米夫定治療的臨床樣本中共檢出40例突變樣本，其中YIDD（204I）13例，YVDD（204V）21例，L180M6例，其中又包括YIDD 和L180M變異3例；YVDD和L180M變異 3例；YIDD和YMDD變異5例.我們用測序法對90例阿德福韋治療的臨床樣本中PCR-LDR法共檢出的8例突變樣本進行驗證，其中A181V/T4例，N236T3例，LDR法中的A181V/T和N236T變異未檢測到.最終兩種方法的不一致的有4例，分別是YIDD1例、YVDD 2例以及阿德福韋混合變異1例.兩種方法的符合率為92.16%.

表2　測序法驗證Table 2　Sequencing verifcation

2.4對4例LDR與測序不一致的標本進行亞克隆測序確認.每例標本挑選20個亞克隆進行測序分析，分別發(fā)現(xiàn)有4個、3個、2個和5個亞克隆含有突變序列，與LDR的檢測結(jié)果一致.

3　討論

慢性乙型肝炎治療的總體目標是最大限度地長期抑制HBV，減輕肝細胞炎癥壞死及肝纖維化，延緩和減少肝功能失代償、肝硬化、HCC及其并發(fā)癥的發(fā)生，核苷（酸）類抗HBV藥物長期治療，可導致耐藥的發(fā)生，進而出現(xiàn)肝炎復發(fā)，甚至肝功能衰竭死亡，或肝硬化/肝功能失代償?shù)葒乐夭l(fā)癥.因此，臨床上需要靈敏的方法檢測耐藥突變，以便及早調(diào)整治療方案.拉米夫定和阿德福韋是目前治療慢性乙型肝炎的一線藥物之一，但隨著治療時問的延長其耐藥突變率也逐漸提高.拉米夫定治療第1年、2年、3年、4年耐藥比例為分別為14%、38%、49%、66%）［1］.阿德福韋治療2、3和5年的耐藥率分別為2.0%、5.9%和29.0%［8－11］.

盡管有多種方法可以用來監(jiān)測拉米夫定和阿德福韋耐藥突變，但臨床上應用最多的還是測序法和線性探針反向雜交技術（Line probe assay，LiPA）.測序法敏感性較低，只能檢測到病毒群體中20%以上的突變株，不能進行高通量檢測，且其結(jié)果判斷需要對測序圖譜進行認真細致的分析.LiPA由于價格昂貴，不適合在HBV高度流行的發(fā)展中國家大面積推廣.LDR技術已經(jīng)廣泛應用于單核苷酸多態(tài)性分析，并且成功應用于低比例HBV拉米夫定耐藥突變株的檢測，可以檢測到HBV群體中1%的YIDD變異株［11－14］.

高溫連接酶檢測反應技術（ligase detection reac-tion，LDR）是一種新興的單核苷酸多態(tài)性（single nu-cleotide polymorphism，SNP）分型檢測方法.其原理是高溫連接酶檢測到模板DNA與兩條探針DNA的接頭處存在著堿基錯配，則連接反應不能進行；即如果探針與模板有一個堿基不配對，連接反應不能進行，如果探針與模板完全互補，連接反應完成.與其它檢測技術相比，LDR檢測技術擁有準確度高、通用性強、通量大、操作簡單、成本低等眾多明顯優(yōu)勢［15－18］.

本研究檢測的標本均來自接受拉米夫定和阿德福韋治療3年以上且血清HBV DNA濃度大于103拷貝/mL的患者.90例拉米夫定治療患者中共有43例（47.78%）檢出拉米夫定耐藥突變，且有32例出現(xiàn)臨床耐藥，90例阿德福韋治療患者中共有8例（8.89%）檢出阿德福韋耐藥突變，且有5例出現(xiàn)臨床耐藥，結(jié)果表明長期接受拉米夫定和阿德福韋治療仍然沒有產(chǎn)生病毒學完全應答的患者發(fā)生耐藥突變的比例比較高.本方法應用于拉米夫定和阿德福韋治療的耐藥監(jiān)測，有助于早期發(fā)現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，合理確定治療方案.

核苷（酸）類藥物治療期間耐藥發(fā)生是不可完全避免的，選用適當?shù)乃幬锖蛢?yōu)化治療方案可以最大程度地預防和延緩耐藥的發(fā)生.一旦發(fā)生耐藥，如果不及時發(fā)現(xiàn)，將給治療方案帶來盲目性，因此，特異性好、靈敏度高的耐藥檢測方法對提高臨床用藥針對性具有很好的指導意義.

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［責任編輯：朱穎?］

Application of ligase detection reaction（LDR）in detection of Lamivudine-resistant and Adefovir-resistant mutations

SHAN Youlan1，JIANG Peixue2
（1.Liver Disease Laboratory，Medical University，the Second Affiliated Hospital of Chongqing，Chongqing 400038，China；2.Department of Infectious Diseases，Huashan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200233，China）

Aim：To investigate the feasibility of LDR（ligase detection reaction）as a technique to de-tect HBV Lamivudine-resistant and Adefovir-resistant mutations.Methods：LDR and PCR techniques were used to detect the mutations in the region of hepatitis B virus gene with primers and probes.Re-sults：This method can well distinguish between wild-type and mutant plasmid vectors，and the sequen-cing results were well in agreement with LDR test results for the clinical samples of 90 cases.Conclu-sion：LDR method can be applied in the detection of Lamivudine-resistant hepatitis B virus and Adefovir resistance for clinical samples.

hepatitis B virus；Lamivudine；Adefovir；resistance mutations

R446.9

A

1000－9965（2015）06－0509－06

10.11778/j.jdxb.2015.06.012

2015－06－30

上?？莆瘎?chuàng)新發(fā)展基金項目（11DZ1920403）

單幼蘭（1967－）女，研究方向：傳染病的臨床分子診斷

江培學，男，復旦大學博士，Tel：021－60765836；E－mail：jiangpeixue＠126.com